Кирсанова Л.А.¹, Баранова Н.В.¹, Бубенцова Г.Н.¹, Скалецкая Г.Н.¹, Перова Н.В.², Севастьянов В.И.² , Скалецкий Н.Н.¹

¹ Лаборатория клеточной трансплантации ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава РФ, Москва, Российская Федерация
² Лаборатория тканевой инженерии и систем доставки отдела биомедицинских технологий
и тканевой инженерии ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава РФ, Москва, Российская Федерация

Цель. Изучение влияния микроструктурированного коллагенсодержащего гидрогеля (биоматрикса) на выживаемость и особенности роста культуры островковых клеток при их совместной инкубации. Материалы и методы. В качестве биоматрикса использовали микроструктурированный коллагенсодержащий гидрогель линейного ряда Сферо®ГЕЛЬ. Культуры островковых клеток, полученные из поджелудочной железы новорожденных кроликов, засевали на поверхность биоматрикса, заливали ростовой средой и помещали в СО2-инкубатор. Изменения, происходившие с биоматриксом и культурами, фиксировали с помощью инвертированного микроскопа и гистологических исследований, включая иммуногистохимический анализ. Результаты. Присутствие микроструктурированного коллагенсодержащего гидрогеле- вого матрикса при инкубации флотирующих культур островковых клеток способствовало длительному сохранению их структурной целостности и гормональной активности. Одновременно выявлено форми- рование культур прогениторных клеток поджелудочной железы, являющихся предшественниками островковых клеток. Заключение. Коллагенсодержащий гидрогель оказывает благоприятное действие на формирование и выживание культур островковых клеток и может быть использован в качестве матрикса тканеинженерной конструкции поджелудочной железы.

Ключевые слова: культуры островковых клеток поджелудочной железы, микроструктурированный коллагенсодержащий гидрогель.

Kirsanova L.A.¹, Baranova N.V.¹, Bubentsova G.N.¹, Skaletskaya G.N.¹, Perova N.V.², Sevastianov V.I.², Skaletskiy N.N.¹

1 Laboratory of cell transplantation «V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs», Moscow, Russian Federation ² Laboratory of tissue engineering and delivery systems, department of biomedical technologies and tissue engineering, «V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs», Moscow, Russian Federation

Aim. A study of the influence of microstructured collagen hydrogel (biomatrix) on survival and growth charac- teristics of islet cell cultures at their co-incubation. Materials and methods. As a biomatrix, the microstructured collagen hydrogel of linear series Sphero® GEL was used. Islet cell cultures obtained from newborn rabbit pan- creas were inoculated onto the biomatrix surface, covered with growth medium, and placed in a CO2 incubator. Changes occurring with biomatrix and cultures were observed by means of an inverted microscope and histolo- gical studies, including immunohistochemical analysis. Results. The presence of the microstructured collagen hydrogel matrix during the incubation of floating islet cell cultures promoted long-term preservation of the structural integrity and hormonal activity. Simultaneously the formation of cultures of pancreatic progenitor cells (islet cells precursors) was observed. Conclusion. Collagen hydrogel has a favorable effect on the formation and survival of islet cell cultures and can be used as a matrix of a tissue-engineered pancreas construct.

Key words: pancreatic islet cell cultures, microstructural collagen hydrogel.

Кирсанова Людмила Анфилофьевна – к. б. н., старший научный сотрудник лаборатории клеточной трансплантации отдела биоме- дицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава РФ, Москва, Российская Федерация. Баранова Наталья Владимировна – научный сотрудник той же лаборатории. Бубенцова Галина Николаевна – научный сотрудник той же лаборатории. Скалецкая Галина Николаевна – на- учный сотрудник той же лаборатории. Перова Надежда Викторовна – д. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории тканевой инженерии и систем доставки отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии того же центра. Севастьянов Виктор Иванович – д. б. н., профессор, руководитель отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии того же центра. Скалец- кий Николай Николаевич – д. м. н., заведующий лабораторией клеточной трансплантации отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии того же центра.

Для корреспонденции: Скалецкий Николай Николаевич. Адрес: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1.

Тел.: 8 (499) 190-42-66; 8-903-790-95-39. E-mail: NSkaletsky@mail.ru

Kirsanova Lyudmila Anfilofievna – senior research, cell transplantation laboratory, department of biomedical technologies and tissue engineering «V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs», Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russian Federation. Baranova Natalia Vladimirovna – research fellow at the same laboratory. Bubentsova Galina Nikolaevna – research at the same laboratory. Skaletskaya Galina Nikolaevna – research fellow at the same laboratory. Perova Nadezhda Viktorovna – leading research fellow, laboratory of tissue engineering and delivery systems, department of biomedical technologies and tissue engineering at the same center. Sevastianov Viktor Ivanovich – professor, head of department of biomedical technologies and tissue engineering at the same center. Skaletskiy Nikolay Nikolaevich – head of cell transplantation laboratory, department of biomedical technologies and tissue engineering at the same center.

For correspondence: Skaletskiy Nikolay Nikolaevich. Address: 123182, Moscow, Shchukinskaya, 1. Tel.: 8 (499) 190-42-66; 8-903-790-95-39. E-mail: NSkaletsky@mail.ru

В настоящее время клеточная трансплантация является одним из наиболее интенсивно развиваю- щихся научных направлений в биологии и медици- не. Одновременное наступательное развитие науки о биоматериалах сделало реальной разработку кле- точно-инженерных и тканеинженерных конструк- ций (ТИК) [1]. В качестве тканевого компонента при создании ТИК применяют, как правило, куль- туры клеток, входящих в состав регенерируемой ткани или являющихся их предшественниками. Помимо клеточной культуры в состав ТИК входит специальный носитель (матрикс, каркас, матрица). Матриксы могут быть выполнены из различных биосовместимых материалов. Большинство из них являются биодеградируемыми, при этом в процес- се их резорбции не должны образовываться проме- жуточные продукты, обладающие токсичностью, резко изменяющие рН среды или ухудшающие рост и дифференцировку клеточной культуры. Клетки полученной культуры наносятся на матрицу, после чего такая трехмерная структура может быть пе- ренесена в биореактор с питательной средой, где инкубируется в течение определенного времени. Другим вариантом создания ТИК может быть на- слоение прокультивированных клеток на матрицу, помещенную в культуральный флакон или пробир- ку с последующим добавлением питательной среды и инкубацией в различных условиях термостата. Проведенные в последние годы исследования пока- зали, что в полной мере качествами, необходимыми для матрицы, входящей в состав ТИК, обладает кол- лагенсодержащая композиция гетерогенного имп- лантируемого геля (торговая марка «Сферо®ГЕЛЬ», производитель ЗАО «БИОМИР сервис», Россия).

Коллагенсодержащую композицию гетерогенно- го имплантируемого геля получают из гидролизата эмбриональных или постнатальных коллагенсодер- жащих тканей животного происхождения (исклю- чая человека), состоящего из двух компонентов: твердого – микрочастиц из сшитого гидролизата и жидкого – исходного гидролизата, взятых в опре- деленном соотношении [патент РФ на изобретение № 2433828].

Формирование гетерогенной структуры гидро- геля позволило существенно увеличить время его биорезорбции по сравнению с биоимплантатами из коллагена, рассасывающимися в течение 3–4 не- дель.

Сферо®ГЕЛЬ относится к классу биополимер- ных имплантатов и предназначен для замещения и восполнения объемов мягких тканей, что происходит за счет стимуляции синтеза собственного внеклеточного матрикса жизнеспособными клетками. Так, например, была показана перспективность применения Сферо®ГЕЛЯ в качестве биодеградируемого матрикса при создании клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани [2] и клеточно-инженерной конструкции печени [3]. Настоящее исследование посвящено изучению влияния микро- структурированного коллагенсодержащего гидро- гелевого матрикса на культуры островковых клеток, что является важным этапом на пути создания ТИК поджелудочной железы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Донорами поджелудочной железы служили 1–3-дневные новорожденные кролики, доставлен- ные из специализированного питомника ФГБУН

«Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА. Культуры островковых клеток (ОК) подже- лудочной железы получали с помощью ранее разра- ботанного нами метода [4]. Для проведения опытов использовали оригинальные культуральные про- бирки конической формы с горизонтальным дном площадью 10 см² (фирма TPP, Швейцария). В качес- тве микроструктурированного коллагенсодержаще- го гидрогелевого матрикса (МКГМ) использовали специально разработанную для клеточных техноло- гий композицию имплантируемого гетерогенного геля линейного ряда Сферо®ГЕЛЬ (ЗАО «БИОМИР сервис», Россия), представляющую собой находя- щийся в шприце стерильный прозрачный, слегка опалесцирующий, вязкий, рН-сбалансированный гидрогель с зернистой структурой. Средний раз- мер микрочастиц – 150 ± 20 мкм, вязкость МКГМ – 62,9 ± 7,9 Па и рН – 6,8 ± 0,1.

Биоматрикс в количестве 2 мл выдавливали из стерильного шприца и равномерно распределяли по дну культуральной пробирки. Затем флотиру- ющую фракцию культуры, сформировавшуюся после 12 суток инкубации 40 измельченных под- желудочных желез новорожденных кроликов, наслаивали на МКГМ, покрывая всю его поверх- ность. После добавления 7–8 мл ростовой среды 199 (без сыворотки) пробирку помещали в инку- батор с увлажненной атмосферой, содержащей 5% СО2. Смена среды проводилась каждые 2–3 дня. Наблюдение за культурой, инкубируемой вместе с биоматриксом, проводили в инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TS 100 путем ежеднев- ного мониторинга, и значимые изменения фик- сировали с помощью цифровой фотокамеры.

Для гистологического исследования на определенных сроках совместной инкубации культуры и МКГМ

(7 и 14 дней) материал фиксировали в жидкости Буэна. После рутинной процедуры обезвоживания образцы заливали в парафин. Срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также подвергали иммуногистохимическому ок- рашиванию по стандартной методике с пероксида- зой хрена для выявления основных типов ОК с ис- пользованием соответствующих моноклональных антител: antiinsulin и antiglucagon (Sigma). Для выявления протокового эпителия окрашивание препаратов на цитокератин 19 осуществляли с ис- пользованием Novocastra Concentrated Peroxidase Detection System (RE 7130-K, Leica Microsystems), следуя инструкции производителя. Предваритель- но перед окрашиванием депарафинированные срезы подвергали ретривизации инкубацией в 0,1%-ном растворе трипсина при 37 °С в течение 30 минут.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

К 12-дневному сроку инкубации микрофрагмен- тов поджелудочной железы новорожденных кроли- ков происходило формирование культуры, которая состояла в основном из флотирующей фракции. Последняя представляла собой плотные остров- ковоподобные структуры, в которых методом им- муногистохимии определялись основные типы ОК – бета-клетки и альфа-клетки (рис. 1, 2). При совместной, достаточно длительной (2 недели) ин- кубации культур и биоматрикса во флотирующих микрофрагментах не выявлялось выраженных де- структивных изменений, и с помощью иммуно- гистохимического окрашивания подтверждалось сохранение значительного количества гормональ- но-активных ОК как на 7-е, так и на 14-е сутки сокультивирования.

Это свидетельствовало, по меньшей мере, об отсутствии отрицательного влияния МКГМ на выживаемость и морфофункциональные качества культур ОК. При этом отмечалось при- крепление таких культур к поверхности биомат- рикса и их распластывание, которое, вероятно, обеспечивало наилучшие условия для выживания и сохранения функции ОК (рис. 3). Часть флотирующих культур, соединившихся с МГМК, содержа- ли, как показал иммуногистохимический анализ, значительное количество клеток, которые демонстрировали позитивную реакцию при окрашивании антителами к цитокератину 19 – специальному маркеру протокового эпителия (рис. 4).

Одновременно в процессе совместной инкубации культур, полученных из поджелудочной железы новорожденных кроликов, с биоматриксом вокруг части прикрепившихся культур формировались эпителиоподобные однослойные зоны роста (рис. 5, 6). На основании ранее проведенных нами исследований [5] можно с большой долей вероятности пред- положить, что клетки, входящие в образовавшийся монослой, также происходят из протокового эпителия и являются прогениторными клетками поджелудочной железы, то есть предшественниками ОК. Перспективность использования прогениторных клеток поджелудочной железы подтверждена исследованиями, в которых показано, что отсутствие предшественников ОК в трансплантате приводит к снижению массы бета-клеток [6], в то время как трансплантация островковой ткани, богатой прогениторными клетками, существенно повышает антидиабетический эффект [7]. Важно отметить, что в контрольном опыте инкубации только флотирующих культур поджелудочной железы ново- рожденных кроликов (без МКГМ) не наблюдалось формирования однослойных зон роста вокруг оча- гов прикрепления культур ко дну культурального флакона.

Проведенные исследования показали, что при- сутствие микроструктурированного коллагенсодержащего гидрогелевого матрикса не только не оказывает токсического воздействия, но благоприятно влияет на выживание флотирующих культур, полученных из поджелудочной железы новорожденных кроликов. При этом сохраняются струк- турные особенности и гормональная способность, характерные для нативных островков поджелудочной железы. Значительная часть флотирующих культур, находящихся в непосредственном контакте с биоматриксом, содержат как зрелые ОК, так и прогениторные клетки поджелудочной желе- зы. Кроме того, при совместной инкубации таких культур с биоматриксом в бессывороточной ростовой среде происходит формирование однослойных культур, которые, по всей видимости, состоят из прогениторных клеток поджелудочной железы, являющихся, как известно, предшественниками ОК. То, что именно МКГМ оказывает стимулирующее действие на образование этих клеток, до- казывает отсутствие формирования однослойных культур при инкубации флотирующих культур в бессывороточной среде без добавления МКГМ. Таким образом, использованный нами биоматрикс способствует длительному сохранению морфо- функциональных свойств флотирующих куль- тур, содержащих ОК, а также способствует росту прогениторных клеток поджелудочной железы. Последний факт позволяет надеяться на то, что с помощью микроструктурированного коллагенсо- держащего гидрогелевого матрикса можно будет существенно увеличить количество островковых клеток, получаемых из донорской поджелудочной железы, которые могут быть использованы в даль- нейшем для трансплантации больным сахарным диабетом. Таким образом, биополимерный гете- рогенный коллагенсодержащий гидрогель оказы- вает благоприятное воздействие на формирование и выживание культур островковых клеток in vitro и может быть использован в качестве матрикса тканеинженерной конструкции поджелудочной железы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов № 13-04-12017 офи_м и № 13-02-12215 офи_м.

Биосовместимые материалы (учебное пособие) / Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. M.: МИА, 2011; 544.
Biosovmestimiye materialy (uchebnoe posobie). Editors Sevastianov V.I. and Kirpichnikov M.P. M: MIA, 2011: 544 (in rus).
2.Surguchenko V.A., Ponomareva A.S., Kirsanova L.A., Bubentsova G.N., Skaletskij N.N., Sevastianov V.I. On the possibility of in vitro formation of tissue-engineered construct of cartilage on the basis of cell-engineered con- struct composed of biopolymer hydrogel matrix and hu- man adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells. Advanced Metals, Ceramics and Composites (ed. H. Tu,
K. Solntsev, R. Zhou), Yunnan Publ. Group Corp., Kun- ming, China, 2013: 242–245.
Готье С.В., Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Кра- шенинников М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Люндуп А.В., Волкова Е.Н., Петраков К.В., Авра- мов П.В., Перова Н.В., Севастьянов В.И. Коррекция хронической печеночной недостаточности при транс- плантации клеток печени в виде суспензии и клеточ- но-инженерных конструкций (экспериментальное исследование). Вестник РАМН. 2013; 4: 44–51. Gauthier S.V., Shagidulin M.Yu, Onishchenko N.A., Krasheninnikov M.E., Il'inskii I.M., Mazhejko N.P., Ly- undup A.V., Volkov E.N., Petrakov K.V., Avramov P.V., Perov N.V., Sevastianov V.I. Correction of chronic liver failure in the transplantation of liver cells in suspension and cell engineering structures (an experimental study). Vestnik RAMSci. 2013; 4: 44–51 (in rus).
4.Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н. Трансплантация ост- ровковых клеток поджелудочной железы. Трансплан- тология (руководство для врачей) / Под ред. акад. В.И. Шумакова. М.: МИА, 2006: 418–430.
Shumakov V.I., Skaletsky N.N. Transplantation of pancreatic islet cells. Transplantologiya (posobie dla vrachey). Editor acad. V.I. Shumakov. M: MIA, 2006: 418–430 (in rus).
Кирсанова Л.А., Баранова Н.В., Скалецкий Н.Н., Зай- денов В.А., Бубенцова Г.Н., Пушкова И.А. Поджелу- дочная железа новорожденных кроликов как источник прогениторных клеток. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2011; 11 (1): 61–64. Kirsanova L.A., Bubentsova G.N., Baranova N.V., Skalet- skiy N.N., Zaydenov V.A., Pushkova I.A. Newborn rabbits pancreas as a source of progenitor cells. Vestnik transplan- tologii i iskusstvennyh organov. 2011; 13 (1): 61–64 (in rus).
6.Lee S.-H., Hao E., Savinov A.Y., Geron I., Strong A.J. Itkin-Ansari P. Human B-cell precursors mature into functional insulin-producing cells in an immunoisolation device: implications for diabetes cell therapies. Trans- plantation, 2009; 87 (7): 983–991.
Smith R.N., Kent S.C., Nagle J., Selig M., Lafrate A.J., Najafian N. Pathology of an islet transplant 2 years after transplantation: evidence for a nonimmunological loss. Transplantation. 2008; 86 (7): 54–62.
Cтатья поступила в редакцию 27.01.2014 г.