КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ В ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ И РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
В.И. Севастьянов
Отдел биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
Отдел биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
CELL-ENGINEERED CONSTRUCTS IN TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE
V.I. Sevastianov
Department of Biomedical Technologies and Tissue Engineering, Academician V.I. Schumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russian Federation
Department of Biomedical Technologies and Tissue Engineering, Academician V.I. Schumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russian Federation
ВВЕДЕНИЕ
Основной целью статьи является краткий обзор исследований по разработке клеточно-инженерных конструкций для тканевой инженерии и регенеративной медицине, проводимых в последние пять лет в ФГБУ «ФНЦТИО им. акад. В.И. Шумакова».
Клеточно-инженерные конструкции (КИК) включают в себя следующие компоненты [1]:
Биополимерные гидрогелевые матриксы.
В последние годы для создания биодеградируемых 3D-матриксов все чаще стали использовать биополимеры, для изготовления которых привлекается целый ряд технологий – от простого «выщелачивания» до технологий прототипирования. Трехмерные биорезорбируемые пористые матриксы являются каркасными элементами КИК, обеспечивающими жизнедеятельность клеток в процессе формирования определенных типов тканей. 3D-матриксы способствуют локализации клеток в области имплантации, одновременно являясь их носителями, временно выполняющими функции естественного внеклеточного матрикса.
При выборе каркаса в клеточно-инженерных конструкциях для регенерации суставного хряща, печени и поджелудочной железы мы решили остановиться на биополимерных микрогетерогенных коллагенсодержащих гидрогелях (БМКГ), получаемых методом ультрадиспергирования с последующей радиационной сшивкой. Наличие микрогетерогенной структуры гидрогеля позволило увеличить время его биодеградации до нескольких месяцев по сравнению с биоимплантатами из коллагена, рассасывающимися в течение 3–4 нед. и повышающими риск формирования рубцовой ткани.
При АСМ-анализе микрочастиц БМКГ была обнаружена пористая структура микрочастиц с размером пор 2–4 мкм, что является позитивным свойством в процессах неоваскуляризации и неоинервации тканеинженерных конструкций на осно- ве БМКГ (рис. 1).
Клеточно-инженерные конструкции (КИК) включают в себя следующие компоненты [1]:
- клетки, способные формировать функционирующий внеклеточный матрикс;
- подходящий биодеградируемый носитель (матрикс) для трансплантации клеток;
- биоактивные молекулы (цитокины, факторы роста), которые оказывают биостимулирующее действие на клетки поврежденной ткани.
Биополимерные гидрогелевые матриксы.
В последние годы для создания биодеградируемых 3D-матриксов все чаще стали использовать биополимеры, для изготовления которых привлекается целый ряд технологий – от простого «выщелачивания» до технологий прототипирования. Трехмерные биорезорбируемые пористые матриксы являются каркасными элементами КИК, обеспечивающими жизнедеятельность клеток в процессе формирования определенных типов тканей. 3D-матриксы способствуют локализации клеток в области имплантации, одновременно являясь их носителями, временно выполняющими функции естественного внеклеточного матрикса.
При выборе каркаса в клеточно-инженерных конструкциях для регенерации суставного хряща, печени и поджелудочной железы мы решили остановиться на биополимерных микрогетерогенных коллагенсодержащих гидрогелях (БМКГ), получаемых методом ультрадиспергирования с последующей радиационной сшивкой. Наличие микрогетерогенной структуры гидрогеля позволило увеличить время его биодеградации до нескольких месяцев по сравнению с биоимплантатами из коллагена, рассасывающимися в течение 3–4 нед. и повышающими риск формирования рубцовой ткани.
При АСМ-анализе микрочастиц БМКГ была обнаружена пористая структура микрочастиц с размером пор 2–4 мкм, что является позитивным свойством в процессах неоваскуляризации и неоинервации тканеинженерных конструкций на осно- ве БМКГ (рис. 1).
Варьируя степень сшивки, размер микрочастиц в геле и отношение твердой (микрочастицы) и жидкой фаз, был создан линейный ряд имплантатов, отличающихся временем биодеградации и реологическими свойствами (табл.).
Для определения размера частиц был использован лазерный анализатор микро- и наночастиц SALD-7101 с использованием приставки для высококонцентрированных растворов (коэффициент преломления коллагенсодержащих растворов 1,45) на базе программного обеспечения WingSALD II: Version 2.1.0. Реологические характеристики трех различных типов инъекционного БМКГ (маркировка 1, 2, 3) были исследованы с помощью ротационного реометра Physica MCR 501 с измерительной геометрией «плита – плита», рекомендованного для измерения характеристик гелей, паст, мягких тел и расплавов полимеров.
Для определения размера частиц был использован лазерный анализатор микро- и наночастиц SALD-7101 с использованием приставки для высококонцентрированных растворов (коэффициент преломления коллагенсодержащих растворов 1,45) на базе программного обеспечения WingSALD II: Version 2.1.0. Реологические характеристики трех различных типов инъекционного БМКГ (маркировка 1, 2, 3) были исследованы с помощью ротационного реометра Physica MCR 501 с измерительной геометрией «плита – плита», рекомендованного для измерения характеристик гелей, паст, мягких тел и расплавов полимеров.
Как видно из таблицы, БМКГ обладают ярко выраженными упругими свойствами, увеличивающимися с увеличением размера микрочастиц.
Преобладание упругих свойств над вязкостными свойствами позволяет БМКГ оставаться в области его имплантации в мягкие ткани до полной резорбции, что было доказано, например, в экспериментах на крысах при имплантации в подкожно-жировую клетчатку.
В предварительно проведенных экспериментах оказалось, что из трех существующих микрогетерогенных гидрогелей для тканеинженерных конструкций суставного хряща, печени и поджелудочной железы подходит гидрогель с наибольшим размером частиц. В связи с этим для создания клеточно- инженерных конструкций был использован один и тот же матрикс БМКГ со средним размером частиц~150 мкм (рис. 2).
Преобладание упругих свойств над вязкостными свойствами позволяет БМКГ оставаться в области его имплантации в мягкие ткани до полной резорбции, что было доказано, например, в экспериментах на крысах при имплантации в подкожно-жировую клетчатку.
В предварительно проведенных экспериментах оказалось, что из трех существующих микрогетерогенных гидрогелей для тканеинженерных конструкций суставного хряща, печени и поджелудочной железы подходит гидрогель с наибольшим размером частиц. В связи с этим для создания клеточно- инженерных конструкций был использован один и тот же матрикс БМКГ со средним размером частиц~150 мкм (рис. 2).
Клеточно-инженерные конструкции хрящевой ткани, печени и поджелудочной железы.
В качестве клеточного компонента для КИК хрящевой ткани человека (КИК ХТч) были выбраны мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека (МСК ЖТч, рис. 3), для КИК печени – ассоциаты сокультивированных аллогенных клеток печени крысы и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки мозга (ММСК КМ) крыс (рис. 4), для КИК поджелудочной железы – культур флотирующих островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов (рис. 5). Функциональная активность КИК ХТч была исследована на модели адъювантного артрита с переходом в артроз (кролики породы Шиншилла).
Правый сустав служил отрицательным контролем, в левый вводили КИК ХТч. В контрольных суставах (отрицательный контроль) наблюдаются изъязвления и слущивания поверхностной пластины, обеднение глубоких слоев клетками, исчезновение колончатого строения, хаотичное расположение хрящевых клеток и очаговое разволокнение хрящевого матрикса.После введения в поврежденный сустав КИК ХТч на 60-е сут имплантации в препаратах хряща обнаруживаются признаки частичного восстановления структуры хряща, выражающиеся в формировании хондроцитами колонок-столбиков в среднем слое, некотором оживлении поверхностного слоя (увеличение количества клеток), появлении изогенных групп хрящевых клеток в матриксе. Полученный результат свидетельствует о наличии существенного регенеративного потенциала биомедицинского клеточного продукта КИК ХТч.
В качестве клеточного компонента для КИК хрящевой ткани человека (КИК ХТч) были выбраны мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека (МСК ЖТч, рис. 3), для КИК печени – ассоциаты сокультивированных аллогенных клеток печени крысы и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки мозга (ММСК КМ) крыс (рис. 4), для КИК поджелудочной железы – культур флотирующих островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов (рис. 5). Функциональная активность КИК ХТч была исследована на модели адъювантного артрита с переходом в артроз (кролики породы Шиншилла).
Правый сустав служил отрицательным контролем, в левый вводили КИК ХТч. В контрольных суставах (отрицательный контроль) наблюдаются изъязвления и слущивания поверхностной пластины, обеднение глубоких слоев клетками, исчезновение колончатого строения, хаотичное расположение хрящевых клеток и очаговое разволокнение хрящевого матрикса.После введения в поврежденный сустав КИК ХТч на 60-е сут имплантации в препаратах хряща обнаруживаются признаки частичного восстановления структуры хряща, выражающиеся в формировании хондроцитами колонок-столбиков в среднем слое, некотором оживлении поверхностного слоя (увеличение количества клеток), появлении изогенных групп хрящевых клеток в матриксе. Полученный результат свидетельствует о наличии существенного регенеративного потенциала биомедицинского клеточного продукта КИК ХТч.
Клеточно-инженерные конструкции хрящевой ткани, печени и поджелудочной железы.
В качестве клеточного компонента для КИК хрящевой ткани человека (КИК ХТч) были выбраны мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека (МСК ЖТч, рис. 3), для КИК печени – ассоциаты сокультивированных аллогенных клеток печени крысы и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки мозга (ММСК КМ) крыс (рис. 4), для КИК поджелудочной железы – культур флотирующих островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов (рис. 5). Функциональная активность КИК ХТч была исследована на модели адъювантного артрита с переходом в артроз (кролики породы Шиншилла).
Правый сустав служил отрицательным контролем, в левый вводили КИК ХТч. В контрольных суставах (отрицательный контроль) наблюдаются изъязвления и слущивания поверхностной пластины, обеднение глубоких слоев клетками, исчезновение колончатого строения, хаотичное расположение хрящевых клеток и очаговое разволокнение хрящевого матрикса.После введения в поврежденный сустав КИК ХТч на 60-е сут имплантации в препаратах хряща обнаруживаются признаки частичного восстановления структуры хряща, выражающиеся в формировании хондроцитами колонок-столбиков в сред- нем слое, некотором оживлении поверхностного слоя (увеличение количества клеток), появлении изогенных групп хрящевых клеток в матриксе. Полученный результат свидетельствует о наличии существенного регенеративного потенциала биомедицинского клеточного продукта КИК ХТч.
Для доказательства функциональной эффективности КИК печени ее имплантировали в паренхиму печени крысы через 7 сут после завершения моделирования хронического токсического фиброзирующего повреждения печени (затравка крыс CCl4 в течение 42 сут). На 7-е сут после окончания затравки наблюдали четко выраженные признаки фиброза (появление ложных долек печени). В контрольной группе крыс, которым вводили физиологический раствор, к 90-м сут после окончания затравки наблюдали дальнейшее разрастание соединительной ткани и формирование внутридолькового фиброза с циррозом печени к 180-м сут. Напротив, в экспериментальной группе животных через 90 сут в клеточных структурах имплантированных клеточно-инженерных конструкций отмечался высокий уровень гликоген-аккумулирующей активности гепатоцитов, а сами конструкции оказываются функционирующими и полностью интегрированными печеночной тканью реципиента. Через 270 сут после имплантации клеточно-инженерные конструкции были полностью интегрированы печеночной тканью реципиента с образованием новых функционирующих кровеносных сосудов и желчных протоков. Проведенные биохимические и гистологические исследования показали, что имплантация предложенных клеточно-инженерных конструкций в паренхиму печени способствует дефиброзированию ткани поврежденной печени и нормализации показателей функции печени по сравнению с контролем.
Функциональная эффективность КИК поджелудочной железы в условиях in vivo была исследована путем ее внутрибрюшинного введения животным (крысы, Вистар) с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа (стрептозотоциновая модель). Определяли не только сахароснижающий эффект выполненной имплантации, но и ее влияние на островковый аппарат собственной поджелудочной железы крыс-реципиентов. Было отмечено существенное снижение уровня гипергликемии, и к исходу 4–5-й нед. содержание глюкозы в крови не превышало 11 ммоль/л, субнормальный уровень которого сохраняется, по меньшей мере, на протяжении 8 нед. (заданный общепринятый срок наблюдения) после имплантации. По окончании эксперимента при гистологическом анализе поджелудочной железы крыс-реципиентов с сахарным диабетом были выявлены признаки активной регенерации β-клеток в островке поджелудочной железы по сравнению с крысами из контрольной группы.
В качестве клеточного компонента для КИК хрящевой ткани человека (КИК ХТч) были выбраны мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека (МСК ЖТч, рис. 3), для КИК печени – ассоциаты сокультивированных аллогенных клеток печени крысы и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки мозга (ММСК КМ) крыс (рис. 4), для КИК поджелудочной железы – культур флотирующих островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов (рис. 5). Функциональная активность КИК ХТч была исследована на модели адъювантного артрита с переходом в артроз (кролики породы Шиншилла).
Правый сустав служил отрицательным контролем, в левый вводили КИК ХТч. В контрольных суставах (отрицательный контроль) наблюдаются изъязвления и слущивания поверхностной пластины, обеднение глубоких слоев клетками, исчезновение колончатого строения, хаотичное расположение хрящевых клеток и очаговое разволокнение хрящевого матрикса.После введения в поврежденный сустав КИК ХТч на 60-е сут имплантации в препаратах хряща обнаруживаются признаки частичного восстановления структуры хряща, выражающиеся в формировании хондроцитами колонок-столбиков в сред- нем слое, некотором оживлении поверхностного слоя (увеличение количества клеток), появлении изогенных групп хрящевых клеток в матриксе. Полученный результат свидетельствует о наличии существенного регенеративного потенциала биомедицинского клеточного продукта КИК ХТч.
Для доказательства функциональной эффективности КИК печени ее имплантировали в паренхиму печени крысы через 7 сут после завершения моделирования хронического токсического фиброзирующего повреждения печени (затравка крыс CCl4 в течение 42 сут). На 7-е сут после окончания затравки наблюдали четко выраженные признаки фиброза (появление ложных долек печени). В контрольной группе крыс, которым вводили физиологический раствор, к 90-м сут после окончания затравки наблюдали дальнейшее разрастание соединительной ткани и формирование внутридолькового фиброза с циррозом печени к 180-м сут. Напротив, в экспериментальной группе животных через 90 сут в клеточных структурах имплантированных клеточно-инженерных конструкций отмечался высокий уровень гликоген-аккумулирующей активности гепатоцитов, а сами конструкции оказываются функционирующими и полностью интегрированными печеночной тканью реципиента. Через 270 сут после имплантации клеточно-инженерные конструкции были полностью интегрированы печеночной тканью реципиента с образованием новых функционирующих кровеносных сосудов и желчных протоков. Проведенные биохимические и гистологические исследования показали, что имплантация предложенных клеточно-инженерных конструкций в паренхиму печени способствует дефиброзированию ткани поврежденной печени и нормализации показателей функции печени по сравнению с контролем.
Функциональная эффективность КИК поджелудочной железы в условиях in vivo была исследована путем ее внутрибрюшинного введения животным (крысы, Вистар) с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа (стрептозотоциновая модель). Определяли не только сахароснижающий эффект выполненной имплантации, но и ее влияние на островковый аппарат собственной поджелудочной железы крыс-реципиентов. Было отмечено существенное снижение уровня гипергликемии, и к исходу 4–5-й нед. содержание глюкозы в крови не превышало 11 ммоль/л, субнормальный уровень которого сохраняется, по меньшей мере, на протяжении 8 нед. (заданный общепринятый срок наблюдения) после имплантации. По окончании эксперимента при гистологическом анализе поджелудочной железы крыс-реципиентов с сахарным диабетом были выявлены признаки активной регенерации β-клеток в островке поджелудочной железы по сравнению с крысами из контрольной группы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты функциональной эффективности КИК хрящевой ткани и поджелудочной железы на экспериментальных моделях, ксеногенных относительно клеточной компоненты КИК, можно объяснить стимулирующим действием биомедицинских клеточных продуктов на процессы собственной регенерации поврежденного суставного хряща и поджелудочной железы. Учитывая низкую способность зрелых гепатоцитов к пролиферации, появление большого количества молодых гепатоцитов при имплантации КИК печени на экспериментальной модели хронической печеночной недостаточности в какой-то мере может быть также связано с ее способностью стимулировать собственную регенерацию поврежденной печени. Биостимулирующее действие разработанных КИК на регенерацию поврежденных структур, скорее всего, обусловлено интенсификацией процессов миграции стволовых клеток из окружающих тканей в зону поражения с последующей их дифференцировкой.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов 13-04- 12017 офи_м и в части разработки инъекционных форм клеточно-инженерных конструкций, при финансовой поддержке Минобрнауки в рамках Соглашения № 14.610.21.0001 в части разработки экспериментальных моделей, при финансовой поддержке РНФ в рамках гранта № 14-25-00055 в части проведения гистоморфологического анализа.
Исследование частично профинансировано грантом Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных исследований НИ-6294.2014.7.
Полученные результаты функциональной эффективности КИК хрящевой ткани и поджелудочной железы на экспериментальных моделях, ксеногенных относительно клеточной компоненты КИК, можно объяснить стимулирующим действием биомедицинских клеточных продуктов на процессы собственной регенерации поврежденного суставного хряща и поджелудочной железы. Учитывая низкую способность зрелых гепатоцитов к пролиферации, появление большого количества молодых гепатоцитов при имплантации КИК печени на экспериментальной модели хронической печеночной недостаточности в какой-то мере может быть также связано с ее способностью стимулировать собственную регенерацию поврежденной печени. Биостимулирующее действие разработанных КИК на регенерацию поврежденных структур, скорее всего, обусловлено интенсификацией процессов миграции стволовых клеток из окружающих тканей в зону поражения с последующей их дифференцировкой.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов 13-04- 12017 офи_м и в части разработки инъекционных форм клеточно-инженерных конструкций, при финансовой поддержке Минобрнауки в рамках Соглашения № 14.610.21.0001 в части разработки экспериментальных моделей, при финансовой поддержке РНФ в рамках гранта № 14-25-00055 в части проведения гистоморфологического анализа.
Исследование частично профинансировано грантом Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных исследований НИ-6294.2014.7.