Клеточно-инженерная конструкция хрящевой ткани человека Получение и культивирование МСК ЖТч Мезенхимальные стромальные клетки получали из образцов подкожно-жировой клетчатки человека по стандартной методике, описанной ранее [26]. Кратко: жировую ткань отмывали от крови в фосфатно-солевом растворе с добавлением антибиотиков, механически измельчали до получения гомогенной массы, которую затем обрабатывали раствором кол- лагеназы Type IA (Sigma, # C98891, США) из расчета 600 ед/г ткани. Фермент инактивировали ростовой средой (РС) для мезенхимальных стволовых клеток человека MesenPRO RS™ без глютамина, с ростовыми добавками MesenPRO RS™ Growth Supplement (Gibco® by Life Technologies™, USA). Клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 мин. Осадок фильтровали через набор фильтров с диаметром пор 100 мкм и 70 мкм, ресуспендировали в РС и рассеивали в культуральные флаконы (Corning- Costar, США). Культивирование осуществляли в стандартных условиях: при температуре 37 °С во влажной атмосфере, содержащей (5 ± 1)% СО2. Замену РС проводили каждые 3 суток. Визуально культуру оценивали с помощью инвертированного микроскопа (Micros MC700, Австрия). Для получения КИК ХТч использовали МСК ЖТч 2 – 3 пассажей.
Биополимерный гидрогелевый коллагенсодержащий матрикс В качестве биодеградируемого матрикса был выбран зарегистрированный в России биополимерный микроструктурированный коллагенсодер- жащий гидрогель (БМКГ) – композиция гетерогенного имплантируемого геля (торговый знак Сферо®ГЕЛЬ, ФСР 2012/13033 от 01.02.2012 г., производитель ЗАО «БИОМИР сервис», г. Краснознаменск, Россия). Сферо®ГЕЛЬ содержит практически все компоненты внеклеточного матрикса тканей сельскохозяйственных животных, обладает высокими биосовместимыми и биостимулирующими свойствами и предназначен для замещения дефектов мягких тканей, включая применение в клеточных технологиях [21]. Инъекционная форма матрикса Сферо®ГЕЛЬ выпускается в шприцах. Время биорезорбции БМКГ составляет от нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от условий и места имплантации.
Клеточно-инженерная конструкция хрящевой ткани Клеточно-инженерную конструкцию хрящевой ткани (КИК ХТч) оптимального состава, доказанного в экспериментах in vitro [25], получали непосредственно перед введением в сустав. В стерильный двухмиллилитровый шприц, содержащий 1 мл БМКГ, прогретый в термостате до 37 °С, набирали 1 мл суспензии МСК ЖТч 2–3 пассажей, приготовленной в индукционной хондрогенной среде STEMPRO® Chondrogenesis Differentiation Kit (Invitrogen, USA). На мешалке «Вортекс» осуществляли перемешивание КИК ХТч в шприце. Конечная концентрация МСК ЖТч в БМКГ составляла 2 × 106 кл/мл матрикса. Непосредственно до манипуляций по внутрисуставному введению КИК ХТч шприцы находились в СО2-инкубаторе при t 37 °С, но не более 2 ч.
Животные и их содержание В экспериментах использовали кроликов (самки) советская шиншилла, весом 3–3,5 кг, полученных из питомника лабораторных животных ФГУП ОПХ «Манихино», Московская область. Кроликов содержали в металлических клетках по 1 особи. Количество животных – 8. Маркировка животных – индивидуальная.
Кормление проводили комбинированным кормом для лабораторных грызунов. Микробиологический статус кормов соответствует Ветеринарно-санитарным нормам и требованиям к качеству кормов для непродуктивных животных и не оказывает негативного влияния на результаты проводимого теста. Животные получали корм без ограничения. В качестве питья была фильтруемая водопроводная вода в стандартных питьевых бутылочках. Микробиологический статус воды соответствует СанПиН 2.1.4.1074-01
«Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения». В комнате содержания животных поддерживались постоянные условиях окружающей среды: температура 15–18 °C, 50–65% относительная влажность, 12-часовой цикл освещения и 10-кратная смена объема воздуха комнаты в час. Температуру и влажность регистрировали и документировали один раз в сутки. Животных лишали корма на ночь перед взвешиванием, забором крови и эвтаназией. Доступ к воде не ограничивался.
Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986).
Экспериментальная модель адъювантного артрита В существующих экспериментальных моделях ОА факторы, вызывающие патологические изменения суставного хряща, условно можно разбить на три группы [27]. Дистрофические и деструктивные нарушения в суставах могут быть достигну- ты: путем введения в сустав химических веществ (например, гидрокортизона ацетат); физическим воздействием на сустав паражидкостной струей азота; механическими (нагрузка на сустав, иммо- билизация сустава) и травматическими повреж- дениями (дырчатый дефект, рассечение передней связки, скарификация участка суставного хряща, по заранее заготовленному шаблону) и др. Выбор той или иной модели зависит от цели исследования. При оценке функциональной эффективности КИК ХТч нам не было необходимости учитывать патогенез ОА, например, нарушение трофики суставного хряща. В связи с поставленной целью работы экспериментальная модель ОА должна была достоверно и надежно приводить к дистрофическо-деструктивным изменениям гиалинового хряща. Для доказательства возможности репаративной регенерации хрящевой ткани при внутрисуставном введении КИК ХТч была выбрана экспериментальная модель адъювантного артрита [28, 29] с дальнейшим развитием в артроз.
Дизайн исследования Все экспериментальные животные были разбиты на 3 группы. Животные группы 1 (3 кролика) и группы 2 (3 кролика) были использованы для создания экспериментальной модели остеоартроза. На 30-е сутки после моделирования ОА кроликам группы 1 в коленный сустав задней левой лапы вводили 0,5 мл КИК ХТч, а кроликам группы 2 в том же количестве в коленный сустав задней левой лапы вводили БМКГ. В обеих группах коленный сустав задней правой лапы служил контролем (модель артроза). Для сравнительного анализа были использованы интактные кролики – 3-я группа (2 кролика, 4 сустава). Перед внутрисуставным введением КИК ХТч и БМКГ кроликов группы 1 и 2 однократно им- муносупрессировали Сандиммуном (содержание активного вещества циклоспорина 50 мг/мл) в дозе 5 мг/кг. Для обезболивания при внутрисуставном введении образцов БМКГ и КИК ХТч использовали лидокаин-спрей. Продолжительность наблюдения за животными после внутрисуставного введения образцов БМКГ и КИК ХТч составляла около 2 месяцев. Общая продолжительность эксперимента ~120 суток. Для подтверждения развития артрита и его пере- хода в артроз были проведены клинические, гематологические, рентгенологические и гистологические методы исследования.
Создание экспериментальной модели адъювантного артрита Протокол модели адъювантного артрита состоял из 3 этапов:
- подкожное введение (в основание хвоста) 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Thermo scientific) с метилированным бычьим сывороточным альбумином (БСА, Sigma) в концентрации 4 мг/мл;
- повторное подкожное введение 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда с метилированным БСА (м-БСА) в концентрации 4 мг/мл через 2 недели;
- внутрисуставное введение 0,5 мл метилирован- ного БСА в концентрации 2 мг/мл в 7,5% растворе глюкозы через 4 недели в оба коленных сустава задних конечностей кролика после первой подкожной инъекции
Ключевые даты Дата инициации исследования: 26.09.2013 г. Дата завершения исследования: 21.01. 2014 г. Продолжительность исследования: 118 суток.
Дата первого подкожного введения суспензии м-БСА с ПАФ – 26.09.2013 г.
Дата второго подкожного введения суспензии м-БСА с ПАФ – 10.10.2013 г.
Дата внутрисуставного введения м-БСА – 24.10.2013 г.
Дата первого рентгенологического исследования суставов – 17.11.2013 г. (25-е сутки после моделирования ОА, или 53-и сутки от начала эксперимента). Дата внутрисуставного введения КИК ХТч и БМКГ – 17.11.2013 г. (25-е сутки после моделирования ОА, или 53-и сутки от начала эксперимента). Дата второго рентгенологического исследования суставов и завершения эксперимента – 21.01.2014 г. (66 суток после внутрисуставного введения КИКХТч и БМКГ).
Наблюдения и измерения в ходе исследования Наблюдения за животными В течение исследования вели наблюдение за каждым животным. Осмотр включал в себя: внешний вид, состояние шерстного покрова, глаз, носа, характер дыхания, поведение, реакцию на внешние раздражители, болевую реакцию, потребление корма и воды, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания и цвет мочи.
Клинические исследования - Измерение объема коленного сустава (с помощью сантиметровой ленты).
- Измерение локальной температуры (с помощью бесконтактного термометра фирмы Rycom)
Лабораторные исследования - Клинический анализ крови: определение СОЭ, количество лейкоцитов.
- Биохимический анализ крови: определение содержания С-реактивного белка в сыворотке крови.
Забор крови производили из краевой вены уха после 18 часов голодания. Для клинического анализа кровь отбирали в специальные пробирки «Юнивет» с антикоагулянтом ЭДТА. Анализы проводили на гематологическом анализаторе «Медоник» для ветеринарии (Швеция). Для биохимических анализов кровь отбирали в специальные пробирки с гранулами для отделения сыворотки. Биохимический анализ проводили унифицированным методом на биохимическом анализаторе «Стат факс 4500+» (США) с использованием стандартного набора реагентов CRP FS (фирма DiaSys).
Рентгенологические исследования Рентгенологические исследования выполняли на аппарате АРД-2 в двух стандартных взаимно перпендикулярных проекциях (прямой и боковой) до начала создания экспериментальной модели, на 25-е и 90-е сутки моделирования ОА.
Терминальные процедуры Через 66 суток после введения КИК ХТч и БМГ проводили эвтаназию всех групп животных методом воздушной эмболии с предварительной анестезией препаратом «Золетил 100» фирмы «Virbac» в дозе 10 мг/кг.
Гистологические исследования Перед приготовлением гистологических препаратов суставные поверхности оценивали макроскопически (форма, контур, цвет). Фрагменты костей бедра и голени вместе со структурами коленного сустава фиксировали в 10% растворе забуференного формалина не менее 48 часов, декальцинировали в электролитном декальцинирующем растворе (фирма «Лабпоинт», Россия) в течение 48–72 часов, обезвоживали через БЛИ и заключали в парафин. Срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, изучали на световом микроскопе Nikon (Япония) при увеличении 200 и 400.
Обработка данных Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (M) и стандартную ошибку среднего (m), которые представлены в итоговых таблицах. Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica ver.7.0. Достоверность отличий между группами данных оценивали с применением t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05.