Биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ — инъекционный биодеградируемый имплантат для заместительной и регенеративной медицины
В.И. Севастьянов1,2, Н.В. Перова1,2
1. Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова, 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1
2. Институт медико-биологических исследований и технологий, 123557, г. Москва, Б. Тишинский пер., д. 43/20, стр. 2
Севастьянов Виктор Иванович — доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФНЦТИО, директор ИМБИИТ, тел. (499) 196-88-74, e-mail: viksev@yandex.ru
Перова Надежда Викторовна — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории тканевой инженерии и систем доставки отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФНЦТИО, заместитель директора ИМБИИТ, тел. (499) 252-36-09, e-mail: 89266076625@mail.ru
1. Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова, 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1
2. Институт медико-биологических исследований и технологий, 123557, г. Москва, Б. Тишинский пер., д. 43/20, стр. 2
Севастьянов Виктор Иванович — доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФНЦТИО, директор ИМБИИТ, тел. (499) 196-88-74, e-mail: viksev@yandex.ru
Перова Надежда Викторовна — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории тканевой инженерии и систем доставки отдела биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФНЦТИО, заместитель директора ИМБИИТ, тел. (499) 252-36-09, e-mail: 89266076625@mail.ru
Представлен краткий обзор экспериментально-клинических исследований композиции гетерогенного имплантируемого геля — Сферо®ГЕЛЬ, получаемый из тканей животного происхождения по защищенной патентом технологии ультра- диспергирования с последующей радиационной сшивкой. Доклиническими исследованиями доказана биологическая безопасность и функциональная эффективность биоимплантата. Клинические исследования были проведены в ряде крупных медицинских центров Москвы. Приведены примеры экспериментально-клинического применения Сферо®ГЕЛЬ в различных областях заместительной и регенеративной медицины.
Ключевые слова: биорезорбируемый микрогетерогенный гидрогель, биоискусственный внеклеточный матрикс, заместительная хирургия, регенеративная медицина, тканевая инженерия.
Ключевые слова: биорезорбируемый микрогетерогенный гидрогель, биоискусственный внеклеточный матрикс, заместительная хирургия, регенеративная медицина, тканевая инженерия.
Bio-polymer heterogenic hydrogel sphero®gel — an injection biodegradable implant for substitutive and regenerative medicine
V.I. SEVASTYANOV1,2, N.V. PEROVA1,2
1Federal Scientific Center for Transplantology and Artificial Organs named after Acad. V.I. Shumakov, 1 Shchukinskaya St., Moscow, Russian Federation, 123182
2Institute for Medical-Biological Research and Technologies, 43/20 B. Tishinskiy per., building 2, Moscow, Russian Federation, 123557
Sevastyanov V.I. — Doctor of Biology, Professor, Head of the Department of Biomedical Technologies and Tissue Engineering of FSCTAO, Director of IMBRT, tel. (499) 196-88-74, e-mail: viksev@yandex.ru
Perova N.V. — Doctor of Biology, Leading Researcher of the Laboratory of Tissue Engineering and Delivery Systems of the Department of Biomedical Technologies and Tissue Engineering of FSCTAO, Deputy Director of IMBRT, tel. (499) 252-36-09, e-mail: 89266076625@mail.ru
1Federal Scientific Center for Transplantology and Artificial Organs named after Acad. V.I. Shumakov, 1 Shchukinskaya St., Moscow, Russian Federation, 123182
2Institute for Medical-Biological Research and Technologies, 43/20 B. Tishinskiy per., building 2, Moscow, Russian Federation, 123557
Sevastyanov V.I. — Doctor of Biology, Professor, Head of the Department of Biomedical Technologies and Tissue Engineering of FSCTAO, Director of IMBRT, tel. (499) 196-88-74, e-mail: viksev@yandex.ru
Perova N.V. — Doctor of Biology, Leading Researcher of the Laboratory of Tissue Engineering and Delivery Systems of the Department of Biomedical Technologies and Tissue Engineering of FSCTAO, Deputy Director of IMBRT, tel. (499) 252-36-09, e-mail: 89266076625@mail.ru
The article presents a brief review of experimental-clinical research of the composition of heterogenic implantable gel — Sphero®GEL, obtained from animal tissues by the patented technology of ultradispersion with radiation cross-links. The pre-clinic research has proved the biological safety and functional efficiency of the bio-implant. The clinical research was carried out in a number of large medical centers in Moscow. Examples are given of the experimental-clinical application of Sphero®GEL in various branches of substitutive and regenerative medicine.
Key words: bio-resorbed microheterogenic hydrogel, bio-artificial territorial matrix, substitutive surgery, regenerative medicine, tissue engineering.
Key words: bio-resorbed microheterogenic hydrogel, bio-artificial territorial matrix, substitutive surgery, regenerative medicine, tissue engineering.
ВВЕДЕНИЕ
Наибольший интерес для заместительной и регенеративной медицины представляют имплантаты из биологических полимерных материалов (биополимеров), занимающих особую нишу на рынке биорезорбируемых (биодеградируемых) имплантируемых материалов и изделий [1, 2].
Биополимерные материалы или их композиции, содержащие биологически активные вещества, в наибольшей степени удовлетворяют основным тре- бованиям, предъявляемым к имплантируемым изделиям для заместительной и регенеративной медицины таким, как:
Целью настоящей работы является краткий об- зор проведенных исследований, посвященных экс- периментально-клиническому применению нового имплантируемого биодеградируемого материала — Сферо®ГЕЛЬ, разработанного в АНО «Институт ме- дико-биологических исследований и технологий» совместно с ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искус- ственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва.
Основные свойства микроструктурированного биополимерного имплантата Сферо®ГЕЛЬ
Композиция гетерогенного имплантируемого геля Сферо®ГЕЛЬ представляет собой микроструктурированный биополимерный гидрогель, выпускаемый под торговым знаком Сферо®ГЕЛЬ, ФСР 2012/13033 от 01.02.2012 г. Производитель ЗАО «БИОМИР сер- вис», г. Краснознаменск, Россия.
Сферо®ГЕЛЬ получают из гидролизата коллаген- содержащих тканей животного происхождения, с использованием технологии ультрадиспергирования гидрогелей с последующей радиационной сшивкой [5]. По своей сути Сферо®ГЕЛЬ, содержа- щий практически все компоненты внеклеточного матрикса тканей животного происхождения, относится к биоактивным биомиметическим гидрогелям [6]. Наличие микрогетерогенной структуры гидрогеля (рис. 1) позволило увеличить время его биорезорбции до нескольких месяцев по сравнению с биоимплантатами из коллагена, рассасывающихся в течение 3-4 недель и повышающих риск форми- рования рубцовой ткани.
Биополимерные материалы или их композиции, содержащие биологически активные вещества, в наибольшей степени удовлетворяют основным тре- бованиям, предъявляемым к имплантируемым изделиям для заместительной и регенеративной медицины таким, как:
- биосовместимость изделия и продуктов его деструкции;
- наличие биостимулирующих свойств;
- возможность регулировать время биодеградации;
- способность к неоваскуляризации и неоиннервации;
- выполнение функций каркаса и питательной среды для клеточных компонентов тканеинженерных конструкций;
- хорошие адгезивные свойства к клеточным культурам;
- стимулирование процессов пролиферации и дифференциации клеток;
- возможность стерилизации без изменения меди- ко-технических свойств конечного продукта.
Целью настоящей работы является краткий об- зор проведенных исследований, посвященных экс- периментально-клиническому применению нового имплантируемого биодеградируемого материала — Сферо®ГЕЛЬ, разработанного в АНО «Институт ме- дико-биологических исследований и технологий» совместно с ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искус- ственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва.
Основные свойства микроструктурированного биополимерного имплантата Сферо®ГЕЛЬ
Композиция гетерогенного имплантируемого геля Сферо®ГЕЛЬ представляет собой микроструктурированный биополимерный гидрогель, выпускаемый под торговым знаком Сферо®ГЕЛЬ, ФСР 2012/13033 от 01.02.2012 г. Производитель ЗАО «БИОМИР сер- вис», г. Краснознаменск, Россия.
Сферо®ГЕЛЬ получают из гидролизата коллаген- содержащих тканей животного происхождения, с использованием технологии ультрадиспергирования гидрогелей с последующей радиационной сшивкой [5]. По своей сути Сферо®ГЕЛЬ, содержа- щий практически все компоненты внеклеточного матрикса тканей животного происхождения, относится к биоактивным биомиметическим гидрогелям [6]. Наличие микрогетерогенной структуры гидрогеля (рис. 1) позволило увеличить время его биорезорбции до нескольких месяцев по сравнению с биоимплантатами из коллагена, рассасывающихся в течение 3-4 недель и повышающих риск форми- рования рубцовой ткани.
По данным СЭМ (сканирующей электронной микроскопии), Сферо®ГЕЛЬ обладает развитой струк- турой диффузионных пор от 200 до 400 мкм, что по- зволяет клеткам свободно прикрепляться к поверхности микрочастиц (рис. 2). Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) была обнаружена пористая структура микрочастиц с размером пор 2-4 мкм, что является позитивным свойством в процессах неоваскуляризации и неоинервации тканеинженерных конструкций на его основе.
Конечный продукт Сферо®ГЕЛЬ представляет со- бой находящийся в шприце стерильный прозрачный, слегка опалесцирующий, вязко-упругий гидро- гель, имеющий, в ряде случаев, видимую зернистую структуру (рис. 3). Содержание связанной воды в Сферо®ГЕЛЬ не менее 32,8±0,5 мас.%, набухаемость — не ниже 86,6±3,0 мас.%, рН — 6,8-7,2.
Варьируя степень сшивки, размер микрочастиц биополимерного гидрогеля в диапазоне от 30 до 300 мкм и отношение твердой (микрочастицы) и жидкой фаз был создан линейный ряд импланта- тов, отличающихся временем биодеградации и рео- логическими свойствами. Преобладание упругих свойств над вязкостными свойствами позволяют Сферо®ГЕЛю оставаться в области его имплантации в мягкие ткани до полной резорбции, что было доказано, например, в экспериментах на крысах при имплантации в подкожно-жировую клетчатку (рис. 4).
Варьируя степень сшивки, размер микрочастиц биополимерного гидрогеля в диапазоне от 30 до 300 мкм и отношение твердой (микрочастицы) и жидкой фаз был создан линейный ряд импланта- тов, отличающихся временем биодеградации и рео- логическими свойствами. Преобладание упругих свойств над вязкостными свойствами позволяют Сферо®ГЕЛю оставаться в области его имплантации в мягкие ткани до полной резорбции, что было доказано, например, в экспериментах на крысах при имплантации в подкожно-жировую клетчатку (рис. 4).
Биологическая безопасность Сферо®ГЕЛЬ была доказана в экспериментах in vitro и in vivo, проведенных в соответствии с национальным стандартом ГОСТ Р ISO 10993 в лаборатории, аккредитованной для доклинических испытаний медицинских изделий.
Рассмотрим несколько наиболее характерных примеров экспериментально-клинического применения биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля Сферо®ГЕЛЬ [1-4, 7-21].
Сферо®ГЕЛЬ в технологиях заместительной хирургии
Применение микрогетерогенного биоимплантата Сферо®ГЕЛЬ при дегенеративно-дистрофических поражениях суставов
Самой распространенной формой поражения суставов, которая встречается у каждого третьего пациента в возрасте от 45 до 64 лет и у 60-70% больных старше 65 лет, является остеоартроз [22]. В основе заболевания лежит изнашивание, истончение и гибель суставного хряща с выпадением его амортизационной функции с последующим дегенеративно-дистрофическим изменением.
Рассмотрим несколько наиболее характерных примеров экспериментально-клинического применения биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля Сферо®ГЕЛЬ [1-4, 7-21].
Сферо®ГЕЛЬ в технологиях заместительной хирургии
Применение микрогетерогенного биоимплантата Сферо®ГЕЛЬ при дегенеративно-дистрофических поражениях суставов
Самой распространенной формой поражения суставов, которая встречается у каждого третьего пациента в возрасте от 45 до 64 лет и у 60-70% больных старше 65 лет, является остеоартроз [22]. В основе заболевания лежит изнашивание, истончение и гибель суставного хряща с выпадением его амортизационной функции с последующим дегенеративно-дистрофическим изменением.
При проведении проспективного двойного слепо- го плацебо-контролируемоего рандомизированного исследования было достоверно установлено положительное действие внутрисуставного введения Сферо®ГЕЛя в течение не менее 3-х месяцев пациентам с гонартрозом: уменьшение боли и улуч- шение функциональной активности сустава при хорошей переносимости инъекции препарата [16]. Можно предположить, что благодаря биостимулирующим свойствам биоимплантата Сферо®ГЕЛЬ, инициируются процессы собственной регенерации гиалинового суставного хряща.
Применение микрогетерогенного биоимпланта- та Сферо®ГЕЛЬ при поражениях периферической нервной системы
Главным препятствием на пути регенерирующих нервных волокон при хирургическом лечении по- вреждений периферической нервной системы является зона рубца между концами сшитого нерва. Для уменьшения вероятности формирования рубцовой ткани была предложена имплантация Сферо®ГЕЛя в зону хирургического вмешательства [10].
Экспериментальные исследования выполняли на самках нелинейных крыс, весом 200-250 гр. на седалищных нервах обеих задних конечностей. Все животные были разделены на две группы: 1 (контроль) — перерезка седалищного нерва с последующей его сшивкой без введения какого-либо препарата; 2 — перерезка седалищного нерва с введением в зону операции биоимплантата Сферо®ГЕЛЬ. В контрольной группе животных в области шва нерва образовывалась грубая соединительная ткань, содержащая клеточные элементы (фибробласты, фиброциты, шванновские клетки) (рис. 5 А). Среди волокон соединительной ткани рубца отмечали регенерирующие аксоны. При введении Сферо®ГЕЛя в область шва нерва наблюдали формирование более рыхлой рубцовой ткани и улучшение прорастания аксонов через область анатомического повреждения нерва (рис. 5 Б). Доказанный положительный эффект применения Сферо®ГЕЛя при реконструктивной хирургии периферических нервов был подтвержден клиническими исследованиями [11].
Применение микрогетерогенного биоимпланта- та Сферо®ГЕЛЬ при поражениях периферической нервной системы
Главным препятствием на пути регенерирующих нервных волокон при хирургическом лечении по- вреждений периферической нервной системы является зона рубца между концами сшитого нерва. Для уменьшения вероятности формирования рубцовой ткани была предложена имплантация Сферо®ГЕЛя в зону хирургического вмешательства [10].
Экспериментальные исследования выполняли на самках нелинейных крыс, весом 200-250 гр. на седалищных нервах обеих задних конечностей. Все животные были разделены на две группы: 1 (контроль) — перерезка седалищного нерва с последующей его сшивкой без введения какого-либо препарата; 2 — перерезка седалищного нерва с введением в зону операции биоимплантата Сферо®ГЕЛЬ. В контрольной группе животных в области шва нерва образовывалась грубая соединительная ткань, содержащая клеточные элементы (фибробласты, фиброциты, шванновские клетки) (рис. 5 А). Среди волокон соединительной ткани рубца отмечали регенерирующие аксоны. При введении Сферо®ГЕЛя в область шва нерва наблюдали формирование более рыхлой рубцовой ткани и улучшение прорастания аксонов через область анатомического повреждения нерва (рис. 5 Б). Доказанный положительный эффект применения Сферо®ГЕЛя при реконструктивной хирургии периферических нервов был подтвержден клиническими исследованиями [11].
Сферо®ГЕЛЬ в технологиях тканевой и реге- неративной медицины
Регенеративная (восстановительная) медицина — это обобщенный термин для обозначения различных терапевтических и хирургических клеточных технологий, направленных на частичную или пол- ную компенсацию функций поврежденных или утраченных органов (тканей). В регенеративной медицине выделяют два основных направления [2]. Одно из них — регенеративная клеточная (или просто клеточная) терапия связана со стимулированием клеточной/тканевой регенерации с помощью трансплантации стволовых клеток или их ассоциатов с соматическими клетками.
Второе направление заключается в восстановлении целостности и функций тканей и органов с помощью, так называемых, биоискусственных (тка- неинженерных) конструкций (ТИК), включающие в себя следующие компоненты:
Тканеинженерная конструкция хрящевой ткани
В последнее время для получения эквивалента хрящевой ткани разрабатывают тканеинженерные конструкции с применением различных трехмерных полимерных матриксов [2, 23].
В проведенных нами экспериментальных исследованиях в условиях in vivo и in vitro была показана перспективность данного подхода для формирования тканеинженерной конструкции хрящевой ткани человека (ТИК ХТч) в условиях in situ при имплантации клеточно-инженерной конструкции хряще- вой ткани (КИК ХТ), состоящей из биополимерного микроструктурированого гидрогелевого матрикса (Сферо®ГЕЛЬ-лонг) и мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч) [2, 19, 21].
Было доказано, что оптимальными условиями формирования ТИК ХТч in vitro являются хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в процессе культивирования непосредственно в Сферо®ГЕЛЬ- лонг при плотности посева 2×106 кл/мл матрикса. При культивировании КИК ХТ выбранного состава (Сферо®ГЕЛЬ, МСК ЖТч, хондрогенная среда) к 42 суткам хондрогенной дифференцировки наблюдали увеличение клеточной массы, прорастание клеток в толщу биоимплантата и увеличение количества вне- клеточного матрикса, вырабатываемого клетками. Клетки активно пролиферировали и вырабатывали компоненты собственного внеклеточного матрикса, в частности, гликозаминогликаны (ГАГ) и коллаген II типа, которые постепенно замещали резорбирующий гидрогелевый матрикс (фиолетовая окраска), что может говорить о начале формирования in vitro тканеинженерной конструкции ХТ (рис. 6) [21].
Регенеративная (восстановительная) медицина — это обобщенный термин для обозначения различных терапевтических и хирургических клеточных технологий, направленных на частичную или пол- ную компенсацию функций поврежденных или утраченных органов (тканей). В регенеративной медицине выделяют два основных направления [2]. Одно из них — регенеративная клеточная (или просто клеточная) терапия связана со стимулированием клеточной/тканевой регенерации с помощью трансплантации стволовых клеток или их ассоциатов с соматическими клетками.
Второе направление заключается в восстановлении целостности и функций тканей и органов с помощью, так называемых, биоискусственных (тка- неинженерных) конструкций (ТИК), включающие в себя следующие компоненты:
- клетки, способные формировать функционирую- щий внеклеточный матрикс;
- подходящий биодеградируемый носитель (ма- трикс) для трансплантации клеток;
- биоактивные молекулы (цитокины, факторы ро- ста), которые оказывают биостимулирующее дей- ствие на клетки поврежденной ткани.
Тканеинженерная конструкция хрящевой ткани
В последнее время для получения эквивалента хрящевой ткани разрабатывают тканеинженерные конструкции с применением различных трехмерных полимерных матриксов [2, 23].
В проведенных нами экспериментальных исследованиях в условиях in vivo и in vitro была показана перспективность данного подхода для формирования тканеинженерной конструкции хрящевой ткани человека (ТИК ХТч) в условиях in situ при имплантации клеточно-инженерной конструкции хряще- вой ткани (КИК ХТ), состоящей из биополимерного микроструктурированого гидрогелевого матрикса (Сферо®ГЕЛЬ-лонг) и мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч) [2, 19, 21].
Было доказано, что оптимальными условиями формирования ТИК ХТч in vitro являются хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в процессе культивирования непосредственно в Сферо®ГЕЛЬ- лонг при плотности посева 2×106 кл/мл матрикса. При культивировании КИК ХТ выбранного состава (Сферо®ГЕЛЬ, МСК ЖТч, хондрогенная среда) к 42 суткам хондрогенной дифференцировки наблюдали увеличение клеточной массы, прорастание клеток в толщу биоимплантата и увеличение количества вне- клеточного матрикса, вырабатываемого клетками. Клетки активно пролиферировали и вырабатывали компоненты собственного внеклеточного матрикса, в частности, гликозаминогликаны (ГАГ) и коллаген II типа, которые постепенно замещали резорбирующий гидрогелевый матрикс (фиолетовая окраска), что может говорить о начале формирования in vitro тканеинженерной конструкции ХТ (рис. 6) [21].
Эксперименты in vivo подтвердили возможность формирования ТИК хрящевой ткани в месте подкожной имплантации клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани. Через 28 суток в препаратах опытной группы наблюдали более выраженную, по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, резорбцию биополимерного гидрогеля с замещением его рубцовой тканью (рис. 7).
Выявлено прогрессивное увеличение массы кол- лагеновых волокон (рис. 7 Б) и локальное синезеленое окрашивание, характерное для ГАГ. В от- дельных участках имплантата встречаются немногочисленные лакунообразные структуры, характер- ные для хрящевой ткани (рис. 7 А). Можно предположить, что на более поздних сроках собственный внеклеточный матрикс ТИК ХТ постепенно заместит резорбирующийся временный биополимерный ма- трикс Сферо®ГЕЛЬ с образованием полностью биологической хрящевой ткани.
Выявлено прогрессивное увеличение массы кол- лагеновых волокон (рис. 7 Б) и локальное синезеленое окрашивание, характерное для ГАГ. В от- дельных участках имплантата встречаются немногочисленные лакунообразные структуры, характер- ные для хрящевой ткани (рис. 7 А). Можно предположить, что на более поздних сроках собственный внеклеточный матрикс ТИК ХТ постепенно заместит резорбирующийся временный биополимерный ма- трикс Сферо®ГЕЛЬ с образованием полностью биологической хрящевой ткани.
Тканеинженерная конструкция печени
В многочисленных работах для создания ТИК печени привлекают различной природы 2D- и 3D-матриксы, включая децеллюляризованную печень, и клеточные компоненты из разных источников [24].
Проведенная серия исследований по созданию инъекционной тканеинженерной конструкции печени показала перспективность использования живого организма как биореактора для формирования in situ тканеинженерной конструкции печени [12, 17, 18]. Образцы КИК печени, со- стоящие из Сферо®ГЕЛЬ и сокультивированных аллогенных клеток и печени и МСК костного мозга крыс, имплантировали в паренхиму печени крысы через 7 суток после завершения модели- рования хронического токсического фиброзиру- ющего повреждения печени (затравка крыс CCl4 в течение 42 суток). На 7 сутки после окончания затравки наблюдали четко выраженные признаки фиброза (появление ложных долек печени). В контрольной группе крыс, которым вводили физиологический раствор, к 90 суткам после окончания затравки наблюдали дальнейшее разрастание соединительной ткани и формирования внутридолькового фиброза с циррозом печени к 180 суткам.
Напротив, в экспериментальной группе животных через 90 суток в клеточных структурах имплантированных клеточно-инженерных конструкций отмечался высокий уровень гликоген-аккумулирующей активности гепатоцитов, а сами конструкции ока- зываются функционирующими и полностью интегрированными печеночной тканью реципиента. Через 180 суток имплантации клеточно-инженерные конструкции были полностью интегрированы печеночной тканью реципиента с образованием новых функционирующих кровеносных сосудов и желчных протоков (рис. 8).
Проведенные биохимические и гистологические исследования показали, что имплантация предложенной КИК в паренхиму печени способствует дефиброзированию ткани поврежденной печени и нормализации показателей функции печени по сравнению с контролем.
В многочисленных работах для создания ТИК печени привлекают различной природы 2D- и 3D-матриксы, включая децеллюляризованную печень, и клеточные компоненты из разных источников [24].
Проведенная серия исследований по созданию инъекционной тканеинженерной конструкции печени показала перспективность использования живого организма как биореактора для формирования in situ тканеинженерной конструкции печени [12, 17, 18]. Образцы КИК печени, со- стоящие из Сферо®ГЕЛЬ и сокультивированных аллогенных клеток и печени и МСК костного мозга крыс, имплантировали в паренхиму печени крысы через 7 суток после завершения модели- рования хронического токсического фиброзиру- ющего повреждения печени (затравка крыс CCl4 в течение 42 суток). На 7 сутки после окончания затравки наблюдали четко выраженные признаки фиброза (появление ложных долек печени). В контрольной группе крыс, которым вводили физиологический раствор, к 90 суткам после окончания затравки наблюдали дальнейшее разрастание соединительной ткани и формирования внутридолькового фиброза с циррозом печени к 180 суткам.
Напротив, в экспериментальной группе животных через 90 суток в клеточных структурах имплантированных клеточно-инженерных конструкций отмечался высокий уровень гликоген-аккумулирующей активности гепатоцитов, а сами конструкции ока- зываются функционирующими и полностью интегрированными печеночной тканью реципиента. Через 180 суток имплантации клеточно-инженерные конструкции были полностью интегрированы печеночной тканью реципиента с образованием новых функционирующих кровеносных сосудов и желчных протоков (рис. 8).
Проведенные биохимические и гистологические исследования показали, что имплантация предложенной КИК в паренхиму печени способствует дефиброзированию ткани поврежденной печени и нормализации показателей функции печени по сравнению с контролем.
Тканеинженерная конструкция поджелудочной железы
В отличие от биоинженерных конструкций хрящевой ткани и печени работы по созданию ТИК немногочисленны [25]. В качестве матриксов используются, главным образом, гидрогелевые коллаген- содержащие матриксы.
В качестве первого шага создания тканеинженерной конструкции поджелудочной железы явилось исследование влияния Сферо®ГЕЛя на культуры островковых клеток (ОК) [20]. При совместной в течение 2-х не- дель инкубации культур ОК со Сферо®ГЕЛем было от- мечено прикрепление ОК к поверхности биоматрикса. Часть прикрепившихся к биоматриксу ОК содержали значительную часть клеток, демонстрировавших позитивную реакцию при окрашивании антителами к цитокератину 19 — специальному маркеру протокового эпителия. Одновременно в процессе совместной инкубации культур и БМГМ вокруг части прикрепив- шихся культур ОК формировались эпителиподобные однослойные зоны роста, являющимися прогениторными клетками поджелудочной железы, то есть пред- шественниками ОК (рис. 9).
Из представленных результатов следует, что Сферо®ГЕЛЬ способствует длительному сохранению морфо-функциональных свойств флотирующих куль- тур ОК и росту прогениторных клеток поджелудочной железы в условиях in vitro и может быть использован в качестве инъекционного носителя при создании тканеинженерной конструкции поджелудочной железы.
В отличие от биоинженерных конструкций хрящевой ткани и печени работы по созданию ТИК немногочисленны [25]. В качестве матриксов используются, главным образом, гидрогелевые коллаген- содержащие матриксы.
В качестве первого шага создания тканеинженерной конструкции поджелудочной железы явилось исследование влияния Сферо®ГЕЛя на культуры островковых клеток (ОК) [20]. При совместной в течение 2-х не- дель инкубации культур ОК со Сферо®ГЕЛем было от- мечено прикрепление ОК к поверхности биоматрикса. Часть прикрепившихся к биоматриксу ОК содержали значительную часть клеток, демонстрировавших позитивную реакцию при окрашивании антителами к цитокератину 19 — специальному маркеру протокового эпителия. Одновременно в процессе совместной инкубации культур и БМГМ вокруг части прикрепив- шихся культур ОК формировались эпителиподобные однослойные зоны роста, являющимися прогениторными клетками поджелудочной железы, то есть пред- шественниками ОК (рис. 9).
Из представленных результатов следует, что Сферо®ГЕЛЬ способствует длительному сохранению морфо-функциональных свойств флотирующих куль- тур ОК и росту прогениторных клеток поджелудочной железы в условиях in vitro и может быть использован в качестве инъекционного носителя при создании тканеинженерной конструкции поджелудочной железы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, доклиническими и клиническими исследованиями были доказаны высокие биосовместимые и биостимулирующие свойства биополимерного микрогетерогенного гидрогеля Сферо®ГЕЛЬ.
Приоритетными областями применения Сферо®ГЕЛя в настоящее время являются:
Приоритетными областями применения Сферо®ГЕЛя в настоящее время являются:
- хирургическое лечение остеоартроза;
- профилактика формирования грубых послеоперационных рубцовых тканей при хирургическом лечении травм периферических;
- тканевая инженерия и регенеративная медицина. Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках гранта №13-04-12017офи_ми РНФ в рамках гранта №14-25-00055
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ / referenceS
Шумаков В.И., Севастьянов В.И. Биополимерные матриксы для искусственных органов и тканей // Здравоохранение и меди- цинская техника. — 2003. — № 4. — С. 30-32.
Севастьянов В.И., Перова Н.В., Немец Е.А., Сургученко В.А., Пономарева А.С. Примеры экспериментально-клинического при- менения биосовместимых материалов в регенеративной медици- не. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. — М.: МИА, 2011. — С. 237-252.
Перова Н.В., Порунова Ю.В., Урьяш В.Ф., Фаминская Л.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Онищенко Н.А., Севастьянов В.И., Шумаков В.И. Биодеградируемый коллагенсодержащий матрикс СферогельТМ для клеточной трансплантации // Перспективные материалы. — 2004. — № 2. — С. 52-59.
Севастьянов В.И. Биоматериалы, системы доставки лекар- ственных веществ и биоинженерия // Вестник трансплантологии и искусственных органов. — 2009. — Т. XI, № 3. — С. 69-80.
Севастьянов В.И., Перова Н.В. Инъекционный гетерогенный биополимерный гидрогель для заместительной и регенеративной хирургии и способ его получения. Патент РФ № 2433828 (2011).
Fisher S.A., Tam R.Y., Shoichet M.S. Tissue mimetics: engineered hydrogel matrices provide biomimetic environments for cell growth // Tissue Engineering. — 2014. — Part A. — 20 (5, 6). — P. 895-898.
Sevastianov V.I. Research and development of bioartificial organs and tissues by using biopolymer materials // J. Guangdong Non- Ferrous Metals. — 2005. — Vol. 15, № 2-3. — P. 53-59.
Sevastianov V.I., Lubyako A.A., Perova N.V., Grishin S.M. etc. First trial usage of the biodegradable matrix Sphero®GEL in the re- constructive surgery. Материалы IX Российско-Китайского симпозиу- ма «Новые материалы и технологии». В журнале: «Перспективные материалы (специальный выпуск)». — 2007. — Т. 1. — С. 147-152.
Sevastianov V.I., Vasilets V.N., Agapov I.I. Biopolymer implants for high-technology assistance in the field of replacement and regenerative medicine // Rare metals. — 2009. — Vol. 28. — P. 84-86.
Федяков А.Г., Древаль О.Н., Кузнецов А.В., Севастьянов Ф.И., Перова Н.В., Чапандзе Г.Н., Немец Е.А., Сатанова Ф.С. Экспе- риментальное обоснование применения гелевого имплантата «Сферо®Гель» и пленочного имплантата «ЭластоПОБ®» при травме периферической нервной системы в эксперименте // Вест- ник трансплантологии и искусственных органов. — 2009. — Т. XI, № 4. — С. 75-80.
Федяков А.Г., Древаль О.Н., Севастьянов В.И., Перова Н.В., Кузнецов А.В., Чапандзе Г.Н. Экспериментально-клиническое обо- снование применения биодеградируемых имплантатов в хирурги- ческом лечении поражений периферических нервов // Вопросы нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко. — 2010. — № 3. — С. 15-18.
Shagidulin M., Onishchenko N., Krasheninnikov M., Iljinsky I., Mogeiko N., Lundup A., Shemerko N., Andriyanova A., Nemetc E., Sevastjanov V., Gautier S. Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure. Proceeding of 45thCongress of the European Society for Surgical Research — ESSR, Geneva, Switzerland, 9-12 June, 2010. — 2010. — P. 83-86.
Литвак Г.Ю., Баринов А.В., Комаров В.В., Тюнина Г.К., Перо- ва Н.В., Севастьянов В.И., Лубяко А.А., Шумаков В.И. Трансплан- тация первичной культуры островковой ткани ксеногенной под- желудочной железы больным сахарным диабетом // Технологии живых систем. — 2010. — Т. 7, № 1. — С. 19-27.
Сургученко В.А., Пономарева А.С., Кирсанова Л.А, Бубен- цова Г.Н., Скалецкий Н.Н., Севастьянов В.И. Формирование тка- неинженерной конструкции хрящевой ткани в условиях in vitro // Вестник трансплантологии и искусственных органов. — 2013. — 15 (3). — С. 66-72.
Севастьянов В.И., Перова Н.В., Сайковский Р.С., Соловьева И.В. Применение инъекционных форм биополимерных гетерогенных гидрогелей при дегенеративно-дистрофических поражениях су- ставов. Практическое пособие для врачей. — Москва: Триада, 2012. — 27 с.
Сайковский Р.С., Савенкова Н.А., Аверьянов А.В., Лисица А.В. Эффективность применения препарата Сферогель для лечения го- нартроза // Клиническая практика. — 2013. — 3. — С. 4-10.
Готье С.В., Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Крашенинни- ков М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Люндуп А.В., Волкова Е.Н., Петраков К.В., Аврамов П.В., Перова Н.В., Севастьянов В.И. Кор- рекция хронической печеночной недостаточности при трансплан- тации клеток печени в виде суспензии и клеточно-инженерных конструкций (экспериментальное исследование) // Вестник РАМН. — 2013. — № 4. — С. 44-51.
Шагидулин М.Ю., Горкун А.А., Онищенко Н.А., Крашенинни- ков М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Башкина Л.В., Сабурина И.Н., Севастьянов В.И., Готье С.В. Использование МСК различной онто- генетической зрелости для коррекции хронического фиброзирую- щего повреждения печени // Вестник трансплантологии и искус- ственных органов. — 2013. — Т. XV, № 3. — С. 73-82.
Surguchenko V.A., Ponomareva A.S., Kirsanova L.A., Bubent- sova G.N., Skaletskij N.N., Sevastianov V.I. On the Possibility of in Vitro Formation of Tissue-engineered Construct of Cartilage on the Basis of Cell-engineered Construct Composed of Biopolymer Hydrogel Matrix and Human Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stromal Cells, In The Book: «Advanced Metals, Ceramics and Composites», (ed. H. Tu, K. Solntsev, R. Zhou), Yunnan Publ. Group Corp., Kunming, China, 2013. — P. 242-245.
Кирсанова Л.А., Баранова Н.В., Бубенцова Г.Н., Скалецкая Г.Н., Перова Н.В., Севастьянов В.И., Скалецкий Н.Н. Влияние микро- структурированного коллагенсодержащего гидрогеля на культуры островковых клеток поджелудочной железы // Вестник трансплан- тологии и искусственных органов. — 2014. — № 1. — С. 29-33.
Surguchenko V.A., Ponomareva A.S., Kirsanova L.A., Skaleckij N.N., Sevastianov V.I. The cell-engineered construct of cartilage on the basis of biopolymer hydrogel matrix and human adipose tissue- derived mesenchymal stromal cells (in vitro study) // J. Biomed. Mater. Research. — 2014. — 102 (3). Article first published online: 22 APR 2014 / DOI: 10.1002/jbm.a.35197.
Ревматология. Национальное руководство; Под ред. Насо- нова Е.Л., Насоновой В.А. — М.: ГЭОТАР_Медиа, 2010. — 720 c.
Chung C., Burdick J.A. Engineering Cartilage Tissue // Adv. Drug Deliv. Rev. — 2008. —60 (2). — P. 243-262.
Godoy G., Hewitt N.J., Albrecht U. et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME // Archives of Toxicology. — 2013. — 87. — P. 1315-1530.
Amer L.D., Mahoney M.J., Bryant S.J. Tissue Engineering Approaches to Cell Based Type 1 Diabetes Therapy // Tissue Engineering Part B, Reviews. — 2013. — 21 (1). — P. 1-38.
Севастьянов В.И., Перова Н.В., Немец Е.А., Сургученко В.А., Пономарева А.С. Примеры экспериментально-клинического при- менения биосовместимых материалов в регенеративной медици- не. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. — М.: МИА, 2011. — С. 237-252.
Перова Н.В., Порунова Ю.В., Урьяш В.Ф., Фаминская Л.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Онищенко Н.А., Севастьянов В.И., Шумаков В.И. Биодеградируемый коллагенсодержащий матрикс СферогельТМ для клеточной трансплантации // Перспективные материалы. — 2004. — № 2. — С. 52-59.
Севастьянов В.И. Биоматериалы, системы доставки лекар- ственных веществ и биоинженерия // Вестник трансплантологии и искусственных органов. — 2009. — Т. XI, № 3. — С. 69-80.
Севастьянов В.И., Перова Н.В. Инъекционный гетерогенный биополимерный гидрогель для заместительной и регенеративной хирургии и способ его получения. Патент РФ № 2433828 (2011).
Fisher S.A., Tam R.Y., Shoichet M.S. Tissue mimetics: engineered hydrogel matrices provide biomimetic environments for cell growth // Tissue Engineering. — 2014. — Part A. — 20 (5, 6). — P. 895-898.
Sevastianov V.I. Research and development of bioartificial organs and tissues by using biopolymer materials // J. Guangdong Non- Ferrous Metals. — 2005. — Vol. 15, № 2-3. — P. 53-59.
Sevastianov V.I., Lubyako A.A., Perova N.V., Grishin S.M. etc. First trial usage of the biodegradable matrix Sphero®GEL in the re- constructive surgery. Материалы IX Российско-Китайского симпозиу- ма «Новые материалы и технологии». В журнале: «Перспективные материалы (специальный выпуск)». — 2007. — Т. 1. — С. 147-152.
Sevastianov V.I., Vasilets V.N., Agapov I.I. Biopolymer implants for high-technology assistance in the field of replacement and regenerative medicine // Rare metals. — 2009. — Vol. 28. — P. 84-86.
Федяков А.Г., Древаль О.Н., Кузнецов А.В., Севастьянов Ф.И., Перова Н.В., Чапандзе Г.Н., Немец Е.А., Сатанова Ф.С. Экспе- риментальное обоснование применения гелевого имплантата «Сферо®Гель» и пленочного имплантата «ЭластоПОБ®» при травме периферической нервной системы в эксперименте // Вест- ник трансплантологии и искусственных органов. — 2009. — Т. XI, № 4. — С. 75-80.
Федяков А.Г., Древаль О.Н., Севастьянов В.И., Перова Н.В., Кузнецов А.В., Чапандзе Г.Н. Экспериментально-клиническое обо- снование применения биодеградируемых имплантатов в хирурги- ческом лечении поражений периферических нервов // Вопросы нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко. — 2010. — № 3. — С. 15-18.
Shagidulin M., Onishchenko N., Krasheninnikov M., Iljinsky I., Mogeiko N., Lundup A., Shemerko N., Andriyanova A., Nemetc E., Sevastjanov V., Gautier S. Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure. Proceeding of 45thCongress of the European Society for Surgical Research — ESSR, Geneva, Switzerland, 9-12 June, 2010. — 2010. — P. 83-86.
Литвак Г.Ю., Баринов А.В., Комаров В.В., Тюнина Г.К., Перо- ва Н.В., Севастьянов В.И., Лубяко А.А., Шумаков В.И. Трансплан- тация первичной культуры островковой ткани ксеногенной под- желудочной железы больным сахарным диабетом // Технологии живых систем. — 2010. — Т. 7, № 1. — С. 19-27.
Сургученко В.А., Пономарева А.С., Кирсанова Л.А, Бубен- цова Г.Н., Скалецкий Н.Н., Севастьянов В.И. Формирование тка- неинженерной конструкции хрящевой ткани в условиях in vitro // Вестник трансплантологии и искусственных органов. — 2013. — 15 (3). — С. 66-72.
Севастьянов В.И., Перова Н.В., Сайковский Р.С., Соловьева И.В. Применение инъекционных форм биополимерных гетерогенных гидрогелей при дегенеративно-дистрофических поражениях су- ставов. Практическое пособие для врачей. — Москва: Триада, 2012. — 27 с.
Сайковский Р.С., Савенкова Н.А., Аверьянов А.В., Лисица А.В. Эффективность применения препарата Сферогель для лечения го- нартроза // Клиническая практика. — 2013. — 3. — С. 4-10.
Готье С.В., Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Крашенинни- ков М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Люндуп А.В., Волкова Е.Н., Петраков К.В., Аврамов П.В., Перова Н.В., Севастьянов В.И. Кор- рекция хронической печеночной недостаточности при трансплан- тации клеток печени в виде суспензии и клеточно-инженерных конструкций (экспериментальное исследование) // Вестник РАМН. — 2013. — № 4. — С. 44-51.
Шагидулин М.Ю., Горкун А.А., Онищенко Н.А., Крашенинни- ков М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Башкина Л.В., Сабурина И.Н., Севастьянов В.И., Готье С.В. Использование МСК различной онто- генетической зрелости для коррекции хронического фиброзирую- щего повреждения печени // Вестник трансплантологии и искус- ственных органов. — 2013. — Т. XV, № 3. — С. 73-82.
Surguchenko V.A., Ponomareva A.S., Kirsanova L.A., Bubent- sova G.N., Skaletskij N.N., Sevastianov V.I. On the Possibility of in Vitro Formation of Tissue-engineered Construct of Cartilage on the Basis of Cell-engineered Construct Composed of Biopolymer Hydrogel Matrix and Human Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stromal Cells, In The Book: «Advanced Metals, Ceramics and Composites», (ed. H. Tu, K. Solntsev, R. Zhou), Yunnan Publ. Group Corp., Kunming, China, 2013. — P. 242-245.
Кирсанова Л.А., Баранова Н.В., Бубенцова Г.Н., Скалецкая Г.Н., Перова Н.В., Севастьянов В.И., Скалецкий Н.Н. Влияние микро- структурированного коллагенсодержащего гидрогеля на культуры островковых клеток поджелудочной железы // Вестник трансплан- тологии и искусственных органов. — 2014. — № 1. — С. 29-33.
Surguchenko V.A., Ponomareva A.S., Kirsanova L.A., Skaleckij N.N., Sevastianov V.I. The cell-engineered construct of cartilage on the basis of biopolymer hydrogel matrix and human adipose tissue- derived mesenchymal stromal cells (in vitro study) // J. Biomed. Mater. Research. — 2014. — 102 (3). Article first published online: 22 APR 2014 / DOI: 10.1002/jbm.a.35197.
Ревматология. Национальное руководство; Под ред. Насо- нова Е.Л., Насоновой В.А. — М.: ГЭОТАР_Медиа, 2010. — 720 c.
Chung C., Burdick J.A. Engineering Cartilage Tissue // Adv. Drug Deliv. Rev. — 2008. —60 (2). — P. 243-262.
Godoy G., Hewitt N.J., Albrecht U. et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME // Archives of Toxicology. — 2013. — 87. — P. 1315-1530.
Amer L.D., Mahoney M.J., Bryant S.J. Tissue Engineering Approaches to Cell Based Type 1 Diabetes Therapy // Tissue Engineering Part B, Reviews. — 2013. — 21 (1). — P. 1-38.