Л.А. Кирсанова, Н.В. Баранова, Г.Н. Бубенцова, В.И. Севастьянов

ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация.

Для корреспонденции: Баранова Наталья Владимировна. Адрес: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1. Тел. (499) 190-42-66. E-mail: barnats@yandex.ru.

L.A. Kirsanova, N.V. Baranova, G.N. Bubentsova, V.I. Sevastianov

V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow, Russian Federation

For correspondence: Baranova Natalya Vladimirovna. Address: 1, Shchukinskaya st., Moscow, 123182, Russian Federation. Tel. (499) 190-42-66. E-mail: barnats@yandex.ru

Трансплантация островков Лангерганса является обещающей альтернативой органной трансплантации поджелудочной железы при лечении сахарного диабета и может обеспечивать инсулинонезависимость больных на некоторый срок [1, 2]. Ограни- ченное время функционирования трансплантата в определенной степени может быть связано с повреждением островков во время процедуры изоля- ции [3, 4]. В процессе выделения островки не толь- ко утрачивают васкуляризацию и иннервацию, но также лишаются связей с внеклеточным матриксом (ВКМ), играющим значимую роль в сохранности островков. Показано, что компоненты ВКМ (коллаген, ламинин, фибронектин) участвуют в обес- печении механической поддержки, сохранении це- лостности и функционирования островков [5–8]. Воссоздание (имитация) нативного микроокружения может способствовать сохранению структуры и функции изолированных островков in vitro и in vivo [5, 6, 9, 10].

Наиболее важным по значимости среди компонентов ВКМ является коллаген, самый распространенный белок у млекопитающих [9, 10]. В панкреатической ткани широко распространены коллагены I и IV типа, которые не только выполняют поддерживающую, каркасную роль, но и, связываясь с рецепторами трансмембранных белков, оказывают влияние на функции островковых клеток [3, 4, 10]. Показано, что островки, культивируемые на коллагенсодержащих матриксах, длительное время после выделения сохраняли жизнеспособность и прояв- ляли секреторную активность [5, 11]. Трансплантация таких островков оказывалась более успешной: островки сохраняли характерную для них архитектонику и отвечали секрецией инсулина при стиму- ляции глюкозой [3, 6].

Наибольший, с нашей точки зрения, интерес представляют собой матриксы из многокомпонентных гидрогелей, получаемых из тканей сельскохозяйственных животных и относящихся к так на- зываемым биомиметикам ВКМ, обеспечивающие сходное с ВКМ микроокружение для роста клеток [12]. К таким биомиметикам ВКМ относится биополимерный микроструктурированный колла- генсодержащий гидрогель (БМКГ-матрикс) – многокомпонентный продукт из природных соединений [13]. Функциональная эффективность БМКГ-матрикса была доказана, например, при ле- чении гонартроза и травматических повреждениях периферических нервов [14–16].

Ранее нами было изучено влияние биополимер- ного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля (БМКГ) на органотипические культуры островковых клеток новорожденных кроликов [17].

Известно, что фетальные и неонатальные островковые клетки более устойчивы к условиям гипоксии, нежели островки взрослых животных и человека [18], и легче адаптируются к условиям культивирования in vitro. Более того, в органотипических культурах помимо островковых клеток присутствуют и другие клеточные типы – протоковый эпителий, фибробласты. Согласно Федеральному закону от 23 июня 2016 г. № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах», при разработке биомедицинских клеточных продуктов, в том числе клеточно-инженерных конструкций поджелудочной железы (КИК ПЖ для лечения сахарного диабета), могут быть использованы только культуры ОЛ взрослого организма. В связи с этим актуальной и практически важной задачей является поиск способов повышения функциональной эффективности клеточной компоненты КИК ПЖ.

Настоящая работа посвящена исследованию влияния матрикса БМКГ на жизнеспособность и со- хранность изолированных ОЛ половозрелых крыс в процессе их культивирования.

Экспериментальные животные
Исследования проводили на половозрелых кры- сах-самцах линии Vistar (180–220 г), полученных из питомника лабораторных животных ФГУП ОПХ
«Манихино». Акклиматизацию и содержание лабораторных животных осуществляли в соответствии с ГОСТ ISO 10993-2-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских из- делий». Часть 2. «Требования к обращению с жи- вотными».
Все манипуляции с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» от 1973 г. и правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986).

Коллагенсодержащий матрикс
В качестве коллагенсодержащего матрикса при культивировании островков Лангерганса (ОЛ) был выбран БМКГ-матрикс из линейного ряда композиции имплантируемого гетерогенного геля (рег. уд. № ФСР 2012/13033 от 15.07.2015 г., торговый знак Сферо®ГЕЛЬ, АО «Биомир сервис», г. Краснознаменск) [19]. Ранее проведенные исследования показали, что из существующего линейного ряда БМКГ-матриксов оптимальным для клеточно- и тканеинженерных конструкций является БМКГ со следующими характеристиками: средний размер микрочастиц – 145,79 ± 0,09 мкм; модуль упругости – 1170 ± 12 Па; модуль вязкости – 62,9 ± 7,9 Па; набухаемость – не ниже 86,6 ± 3,0 масс.%; время резорбции – до 9 месяцев.

Изоляция островков лангерганса
Островки Лангерганса выделяли из поджелудочной железы 11 крыс. Процедуру выделения ос- тровков проводили, ориентируясь на классическую методику с использованием коллагеназы с некото- рыми модификациями [20, 21].

Cубтотально удаленную в стерильных условиях поджелудочную железу помещали в чашку Петри. Затем интрапаренхиматозно несколькими последовательными инъекциями вводили 10 мл раствора коллагеназы I типа («Sigma», активность 150 ед./мл) (рис. 1). Растянутую таким образом железу аккурат- но разделяли на 10–12 равных частей, переносили во флакон и инкубировали 40 мин при 37,0–37,5 °С. Переваривание останавливали добавлением холод- ного (4 °С) раствора Хенкса. Флакон с дезагрегированной панкреатической тканью мягко встряхивали вручную в течение нескольких секунд. Образовав- шиеся мелкие фрагменты фильтровали через метал- лическое сито с диаметром ячеек 0,6 мм. Перевар собирали в конические пробирки и центрифугировали 1 мин при скорости 600 об./мин.

Оценка содержимого осадка и надосадочной жидкости, проведенная с помощью инвертирован- ного микроскопа (Nikon Eclipse TS 100), показала, что на дно пробирок осаждались клетки ацинарной ткани и одиночные островки. Основная масса ост- ровков обнаруживалась в надосадочной жидкости (супернатанте). Супернатант осторожно переноси- ли в центрифужную пробирку и дважды отмывали 1 мин при 1100 об./мин.

Идентификация и подсчет островков
Идентификацию и подсчет островков осуществляли, проводя окрашивание дитизоном. В чашку Петри вносили 0,2–0,4 мл тканевой взвеси, добавляли 0,1–0,2 мл раствора дитизона и инкубировали в термостате в течение 20–30 мин при 37,0 °С. Дитизон избирательно окрашивал панкреатические островки, при этом ацинарные клетки оставались неокрашенными. Подсчет окрашенных островков проводили с помощью инвертированного микро- скопа при увеличении объектива ×10.

Культивирование изолированных островков лангерганса
Изолированные ОЛ ресуспендировали в среде DMEM, содержащей глюкозу (4,5 г/л), 10% эмбриональную телячью сыворотку, 2 мМ L-глутамина, 1 М Hepes и 80 мкг/мл гентамицина и по 1,5–2,0 мл вносили в 25 см2 культуральные флаконы. Культи- вирование проводили при 37,0 °С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Смену культураль- ной среды осуществляли через 2 суток инкубации.

Ежедневный мониторинг и фотосъемку культивируемых островков проводили с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse TS 100 (Nikon, Япония), оснащенного цифровой фотокамерой.

На третьи сутки инкубации в один из культуральных флаконов вводили 0,5–0,7 мл БМКГ и про- должали культивирование в прежних условиях до достижения недельного срока. Островки, культивированные без добавления БМКГ, рассматривались в качестве контроля.

Прижизненное окрашивание панкреатических островков
Для определения жизнеспособности культивируемых островков проводили иммунофлуоресцентное окрашивание акридиновым оранжевым и пропидиум-йодидом на 3-и и 6-е сутки инкубации. Для этого 0,2–0,4 мл культуральной взвеси, содержащей островки, помещали в чашку Петри, добавляли 0,02–0,03 мл готового раствора красителей и инкубировали в темноте в течение 15–17 мин. Результат оценивали c помощью люминесцентного микроскопа Nikon Eclipse 50i (Nikon, Япония). Жизнеспособные клетки демонстрировали зеленую флуоресценцию, тогда как погибшие клетки, окрашенные пропидиум-иодидом, приобретали красную.

Гистологическое исследование островков для гистологического исследования свежевы- деленные островки и островки, культивирован-
ные в течение 6–7 суток, фиксировали в смеси Буэна, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, выдерживали в смеси спирта и ксило- ла, ксилоле и заливали в парафин. Срезы толщи- ной 4–5 мкм, полученные на микротоме Leica RM 2245, депарафинировали, регидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином, а также методом иммуногистохимии по классической методике с пероксидазой хрена и использованием антител к инсулину (anti-insulin, «Sigma»). Образование коричневого преципитата в цитоплазме клеток в ре- зультате иммуногистохимического окрашивания позволяло идентифицировать инсулинпозитивные β-клетки в островках.

Свежевыделенные островки
Свежевыделенные островки, наблюдаемые в инвертированном микроскопе, демонстрировали в основном округлую или овальную форму и сохраняли целостность, что свидетельствовало о том, что в процессе изоляции макроструктура островков не пострадала (не была повреждена) (рис. 2, а). Значительная часть островков имела ровную поверхность, тогда как на поверхности некоторых островков обнаруживались неровности, шероховатости, образованные остатками окружающей экзокринной ткани. Окрашивание дитизоном придавало островкам терракотово-красный цвет и позволяло не только идентифицировать островки (рис. 3), но и подсчитать их количество: в 1 мл клеточной взвеси содержалось 235 ± 32 островка, а в целом из одной ПЖ крысы нам удавалось выделить 700–800 островков. Проведенное гистологическое исследование по- казало, что островки на данном этапе сохраняли характерную для них структуру с преобладанием инсулинпозитивных β-клеток (рис. 2, б).

Культивированные островки
Наблюдение в инвертированном микроскопе показало, что островки, опытные и контрольные, в течение первых трех суток культивирования сохраняли первоначальные внешние характеристики. Прижизненное окрашивание акридиновым оранжевым и пропидиум-иодидом в люминесцентном микроскопе продемонстрировало зеленую флуоресценцию островков, подтверждающую их жизнеспособность (рис. 4, а). Одиночные, окрашенные в красный цвет пропидиум-иодидом, погибшие аци- нарные клетки обнаруживались лишь в культураль- ной среде, окружающей островки.

Необходимо отметить, что островки, культивированные с коллагенсодержащим гелем, не проявляли адгезивных качеств, и находясь в непосредственной близости, не прикреплялись к гелю в течение всего срока наблюдения.
Через 6 суток культивирования наблюдаемая в инвертированный микроскоп Nikon Eclipse TS 100 морфологическая картина менялась. Обнару- живалось, что поверхность контрольных остров- ков приобретала неровные очертания, становилась бугристой. В некоторых островках наблюдалось появление полостей, а в отдельных островках отмечались признаки фрагментации (рис. 5, а). Прижизненное окрашивание акридиновым оранжевым и пропидиум-иодидом выявляло в сохранившихся островках наряду с живыми появление погибших клеток с красной флуоресценцией (рис. 4, б), что коррелировало с гистологической картиной, выяв- ляющей в таких островках многочисленные клетки с пикнотичными ядрами (рис. 5, б). Таким образом, на рубеже 6 суток культивирования большая часть контрольных островков претерпевала деструктивные изменения.

Островки, культивируемые с коллагенсодержащим матриксом, не обнаруживали признаков деградации структуры в течение 7 суток культивирования (рис. 7, а). Иммунофлуоресцентное окрашивание подтверждало жизнеспособность опытных остров- ков (рис. 6). Гистологическое исследование ОЛ показало, что через 7 суток культивирования островки сохраняли целостность, не фрагментировались. При окрашивании гематоксилином и эозином ОЛ

представляли компактные образования, состоящие из некрупных светлых полигональных клеток с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченным сферической формы ядром. В ядре определялось крупное ядрышко и мелкодиспергированный хроматин (рис. 7, б, в). Описываемая гистологическая картина свидетельствовала о сохранении не только макроструктуры, но и базовой микроструктуры островков. При окрашивании антителами к инсу- лину подавляющее большинство клеток в ОЛ оказывалось иммунопозитивными β-клетками с обильной специфической зернистостью в цитоплазме (рис. 7, г, д).

На основании проведенного морфологического анализа можно сделать вывод о том, что культи- вирование изолированных ОЛ с биополимерным микрогетерогенным коллагенсодержащим гидрогелем – биомиметиком внеклеточного матрикса, обладающего биоактивными свойствами и обеспечивающего для изолированных островков ПЖ сходное с нативным ВКМ микроокружение (нишу), обеспечивает их жизнеспособность, сохраняет целостность и характерную структуру in vitro в течение 7 суток. В то же время при культивировании в стандартных условиях (без добавления матрикса) культуры изо- лированных ОЛ к 6 суткам инкубации претерпевали деструктивные изменения.

Shapiro AM, Hao EG, Lakey JR, Yakimets WJ, Chur­ chill TA, Mitlianga PG, Papadopoulos GK et al. Novel approaches toward early diagnosis of islet allograft re- jection. Transplantation. 2001 Jun 27; 71 (12); 1709– 1718. PMID: 11455247.
Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat. Rev. Endocrinol. 2016 Nov 11. doi: 10.1038/nrendo.2016.178. PMID: 27834384.
Llacua A, de Haan BJ, Sminc SA, de Vos P. Extracel- lular matrix components supporting humanislet function in alginate-based immunoprotective microcapsules for treatment of diabetes. J. Biomed. Mater. Res. A. 2016 Jul; 104 (7): 1788–1796. doi: 10.1002/jbm.a.35706.
Stendahl JC, Kaufman DB, Stupp SI. Extracellular mat- rix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation. Cell Transplantation. 2009; 18 (1): 1–12.
Abualhassan N, Sapozhnikov L, Pawlick RL, Kahana M, Pepper AR, Bruni A, Gala­Lopez B et al. Lung-derived microscaffolds facilitate diabetes reversal after mouse and human intraperitoneal islet transplantation. PLoS One. 2016 May 26; 11 (5): e0156053. doi: 10.1371/jour- nal.pone.0156053. e Collection 2016. PMID 27227978.
Amer LD, Mahoney MJ, Bryant SJ. Tissue engineering approaches to cell-based type 1 diabetes therapy. Tissueengineering. 2014; part B, 20 (5): 455–467. doi: 10.1089/ ten.TEB.2013.04.62. PMID: 24417705.
Hynes RO. The extracellular matrix: not just pretty fib- rils. Science. 2009 Nov 27; 326 (5957): 1216–1219. doi: 10.1126/science.1176009. PMID: 19965464.
Tziampazis E, Sambanis A. Tissue engineering of a bioar- tificial pancreas: modeling the cell environment and de- vice function. Biotechnol. Prog. 1995 Mar-Apr; 11 (2): 115–126. doi: 10.1021/bp00032a001. PMID: 7766095.
Ko JH, Kim YH, Jeong SH, Lee S, Park SN, Shim IK, Kim SC. Collagen esterification enhances the β-cells in 2D and 3D culture systemes. Biochem. Blophys. Res. Commun. 2015 Aug 7; 483 (4): 1084–1090. doi: 10.1016/ j.bbrc.2015.06.062. PMID: 26079884.
Riopel M, Wang R. Collagen matrix support of pancrea- tic islet survival and function. Front. Biosci. (Landmark Ed). 2014 Jan 1; 19: 77–90. PMID: 24389173.
Szebeni GJ, Tancos Z, Feher LZ, Alfoldi R, Kobolak J, Dinnyes A, Puskas LG. Real architecture for 3D Tissue (RAFT) culture system improves viability and maintains insulin and glucagon production of mouse pancreatic islet cells. Cytotechnology. 2017; 69 (2): 359–369. doi: 10.1007/s10616-017-0067-6. PMID: 28/81140.
Fisher SA, Tam RY, Shoichet MS. Tissue mimetics: engi- neered hydrogel matrices provide biomimetic environ- ments for cell growth. Tissue Engineering. 2014; Part A, 20 (5, 6): 895–898.
Севастьянов ВИ, Перова НВ. Инъекционный гетеро- генный биополимерный гидрогель для заместитель- ной и регенеративной хирургии и способ его получе- ния. Патент РФ № 2433828 (2011). Sevast'yanov VI, Perova NV. In''ekcionnyj geterogennyj biopolimernyj gidrogel' dlya zamestitel'noj i regenerativnoj hirurgii i sposob ego polucheniya. Patent RF № 2433828 (2011).
Соловьева ИВ, Шестерня Н, Перова НВ, Севастья­ нов ВИ. Комбинированное применение биополимер- ного гетерогенного гидрогеля и гиалуроновой кис- лоты при ОА (первый опыт). Врач. 2016; 1: 12–17. Solovyeva IV, Shesternya N, Perova NV, Sevastianov VI. Coadministration of heterogeneous biopolymer hydrogel and hyaluronic acid in osteoarthritis: the first experience. Vrach. 2016; 1: 12–17.
Соловьева ИВ, Перова НВ, Севастьянов ВИ. Воз- можности применения биополимерного микрогете- рогенного коллагенсодержащего геля при травмах и заболеваниях опорно-двигательного аппарата. Современная медицина. 2016; 2: 66–69. Solov'eva IV, Perova NV, Sevast'yanov VI. Vozmozhnosti primeneniya biopolimernogo mikrogeterogennogo kollagensoder- zhashchego gelya pri travmah i zabolevaniyah oporno- dvigatel'nogo apparata. Sovremennaya medicina. 2016; 2: 66–69.
Федяков АГ, Древаль ОН, Севастьянов ВИ, Перо­ ва НВ, Кузнецов АВ, Чапандзе ГН. Эксперименталь- но-клиническое обоснование применения биодегра- дируемых имплантатов в хирургическом лечении поражений периферических нервов. Вопросы ней­ рохирургии им. Н.Н. Бурденко. 2010; 3: 15–18. Fe­ dyakov AG, Dreval' ON, Sevast'yanov VI, Perova NV, Kuznecov AV, Chapandze GN. Ehksperimental'no-klinicheskoe obosnovanie primeneniya biodegradiruemyh implantatov v hirurgicheskom lechenii porazhenij peri- fericheskih nervov. Voprosy nejrohirurgii im. N.N. Bur­ denko. 2010; 3: 15–18.
Скалецкий НН, Кирсанова ЛА, Севастьянов ВИ. Раз- работка и экспериментальное исследование ткане- инженерных конструкций поджелудочной железы из культур островковых клеток поджелудочной железы и биодеградируемых носителей с целью стимуляции регенерации β-клеток у больных сахарным диабетом. Трансплантология: итоги и перспективы. 2014; VI: 120–124. Skaletskiy NN, Kirsanova LA, Sevastianov VI. Development and experimental research cell-enginee- ring constructs from cultures of pancreatic islet cells and biodegradable scaffolds in order to stimulate the regene- ration of β-cells in patients with diabetes. Transplantati­ on: results and prospects. 2014; VI: 120–124.
Hawthorne WJ, Simond DM, Stokes R, Patel AT, Wal­ ters S, Burgess J, O Connell PJ. Subcapsular fetal pig pancreas fragment transplantation provides normal blood glucose control in a preclinical model diabetes. Transplantation. 2011 Mar 15; 91 (5): 515–521. doi: 10.1097/TP.0b013e3182079474. PMID: 21183867.
Готье СВ, Шагидулин МЮ, Онищенко НА, Севас­ тьянов ВИ. Разработка и экспериментальное иссле- дование тканеинженерных конструкций печени из ассоциатов клеток печени и биодеградируемых но- сителей. Трансплантология: итоги и перспективы. 2014; VI: 131–136. Gautier SV, Shagidulin MY, Oni­ shchenko NA, Sevastianov VI. Development and expe- rimental research hepar cell-engineering constructs from hepatocytes and biodegrable scaffolds. Transplantation: results and prospects. 2014; VI: 131–136.
Berney T, Molano RD, Cattan P, Pileggi A, Vizzardelli C, Oliver R, Ricordi C, Inveradi L. Endotoxin-mediated delayed islet graft function is associated with increased intra-islet cytokine production and islet cell apoptpsis. Transplantation. 2001 Jan 15; 71 (1): 125–132. PMID: 11211177.
Kenmochi T, Asano T, Jingu K, Iwashita C, Miyauchi H, Takahashi S, Saito T, Ochiai T. Development of a ful- ly automaited islet digestion system. Transplant. Proc. 2000 Mar; 32 (2): 341–343. PMID: 10715434.