Б. Тишинский переулок,
д. 43/20 стр.2
+7 (499) 252-36-09

КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ В ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ И РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ

В.И. Севастьянов


Отдел биомедицинских технологий и тканевой инженерии ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

CELL-ENGINEERED CONSTRUCTS IN TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE

V.I. Sevastianov


Department of Biomedical Technologies and Tissue Engineering, Academician V.I. Schumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russian Federation

ВВЕДЕНИЕ

Основной целью статьи является краткий обзор исследований по разработке клеточ- но-инженерных конструкций для тканевой инже- нерии и регенеративной медицине, проводимых в последние пять лет в ФГБУ «ФНЦТИО им. акад. В.И. Шумакова».

Клеточно-инженерные конструкции (КИК) включают в себя следующие компоненты [1]:

  • клетки, способные формировать функциониру- ющий внеклеточный матрикс;
  • подходящий биодеградируемый носитель (матрикс) для трансплантации клеток;
  • биоактивные молекулы (цитокины, факторы роста), которые оказывают биостимулирующее действие на клетки поврежденной ткани.

Существует два основных подхода к созданию клеточно- или тканеинженерных конструкций, от- носящихся к биомедицинским клеточным продук- там. Первый связан с использованием специального устройства – биореактора, обеспечивающего усло- вия для дифференциации и пролиферации клеток с последующим формированием тканевых структур. Второй путь заключается в использовании в качес- тве биореактора организма реципиента и при воз- можности формирование тканеинженерных конс- трукций in situ, который и был выбран для создания КИК как биомедицинского клеточного продукта для регенерации суставного хряща, печени и под- желудочной железы.

Биополимерные гидрогелевые матриксы. 

В последние годы для создания биодеградируемых 3D-матриксов все чаще стали использовать биопо- лимеры, для изготовления которых привлекается целый ряд технологий – от простого «выщелачива- ния» до технологий прототипирования. Трехмерные биорезорбируемые пористые матриксы являются каркасными элементами КИК, обеспечивающими жизнедеятельность клеток в процессе формиро- вания определенных типов тканей. 3D-матриксы способствуют локализации клеток в области имп- лантации, одновременно являясь их носителями, временно выполняющими функции естественного внеклеточного матрикса.

При выборе каркаса в клеточно-инженерных конструкциях для регенерации суставного хряща, печени и поджелудочной железы мы решили оста- новиться на биополимерных микрогетерогенных коллагенсодержащих гидрогелях (БМКГ), получае- мых методом ультрадиспергирования с последую- щей радиационной сшивкой. Наличие микрогетеро- генной структуры гидрогеля позволило увеличить время его биодеградации до нескольких месяцев по сравнению с биоимплантатами из коллагена, расса- сывающимися в течение 3–4 нед. и повышающими риск формирования рубцовой ткани.

При АСМ-анализе микрочастиц БМКГ была обнаружена пористая структура микрочастиц с размером пор 2–4 мкм, что является позитивным свойством в процессах неоваскуляризации и нео- инервации тканеинженерных конструкций на осно- ве БМКГ (рис. 1).

Рис. 1

АСМ-изображение микрочастиц образца БМКГ-1, полученное методом криоконсервации

Варьируя степень сшивки, размер микрочастиц в геле и отношение твердой (микрочастицы) и жид- кой фаз, был создан линейный ряд имплантатов, отличающихся временем биодеградации и реологическими свойствами (табл.).

Для определения размера частиц был исполь- зован лазерный анализатор микро- и наночастиц SALD-7101 с использованием приставки для вы- сококонцентрированных растворов (коэффициент преломления коллагенсодержащих растворов 1,45) на базе программного обеспечения WingSALD II: Version 2.1.0. Реологические характеристики трех различных типов инъекционного БМКГ (маркировка 1, 2, 3) были исследованы с помощью ротацион- ного реометра Physica MCR 501 с измерительной геометрией «плита – плита», рекомендованного для измерения характеристик гелей, паст, мягких тел и расплавов полимеров.


Характеристические параметры линейного ряда инъекционных форм композиции биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля

Как видно из таблицы, БМКГ обладают ярко выраженными упругими свойствами, увеличива- ющимися с увеличением размера микрочастиц.

Преобладание упругих свойств над вязкостными свойствами позволяет БМКГ оставаться в области его имплантации в мягкие ткани до полной резорб- ции, что было доказано, например, в экспериментах на крысах при имплантации в подкожно-жировую клетчатку.

В предварительно проведенных экспериментах оказалось, что из трех существующих микрогетеро- генных гидрогелей для тканеинженерных конструк- ций суставного хряща, печени и поджелудочной железы подходит гидрогель с наибольшим разме- ром частиц. В связи с этим для создания клеточно- инженерных конструкций был использован один и тот же матрикс БМКГ со средним размером частиц~150 мкм (рис. 2).

Рис. 2

Инъекционная композиция биоматрикса БМКГ-1. Средний размер микрочастиц ~150 мкм

Клеточно-инженерные конструкции хрящевой ткани, печени и поджелудочной железы. 

В качестве клеточного компонента для КИК хряще- вой ткани человека (КИК ХТч) были выбраны ме- зенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека (МСК ЖТч, рис. 3), для КИК печени – ас- социаты сокультивированных аллогенных клеток печени крысы и мультипотентные мезенхималь- ные стромальные клетки мозга (ММСК КМ) крыс (рис. 4), для КИК поджелудочной железы – культур флотирующих островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов (рис. 5). Функциональная активность КИК ХТч была исследована на модели адъювантного артрита с переходом в артроз (кролики породы Шиншилла).


Правый сустав служил отрицательным контролем, в левый вводили КИК ХТч. В контрольных суста- вах (отрицательный контроль) наблюдаются изъ- язвления и слущивания поверхностной пластины, обеднение глубоких слоев клетками, исчезновение колончатого строения, хаотичное расположение хрящевых клеток и очаговое разволокнение хряще- вого матрикса.После введения в поврежденный сустав КИК ХТч на 60-е сут имплантации в препаратах хряща обнаруживаются признаки частичного восстанов- ления структуры хряща, выражающиеся в форми- ровании хондроцитами колонок-столбиков в сред- нем слое, некотором оживлении поверхностного слоя (увеличение количества клеток), появлении изогенных групп хрящевых клеток в матриксе. По- лученный результат свидетельствует о наличии су- щественного регенеративного потенциала биомеди- цинского клеточного продукта КИК ХТч.

Рис. 3


 Культура МСК ЖТч, 2-й пассаж, 2 × 106 кл/мл матрикса. Окрашивание гематоксилином. ×200

Рис. 4


 Ассоциаты из сокультивированных аллогенных клеток печени и ММСК КМ в соотношении 5:1, 3–6 × 106 кл/мл матрикса, крысы-самцы, Вистар, фазово-конт- растная микроскопия. ×20

Рис. 5


 12–14-суточная флотирующая культура островко- вых клеток новорожденных кроликов, 0,2–0,3 × 106 кл/мл матрикса. Иммунопозитивное (коричневое) окрашива- ние бета-клеток антителами к инсулину. ×200 (Скалец- кий Н.Н., неопубликованные данные)

Клеточно-инженерные конструкции хрящевой ткани, печени и поджелудочной железы. 

В качестве клеточного компонента для КИК хряще- вой ткани человека (КИК ХТч) были выбраны ме- зенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека (МСК ЖТч, рис. 3), для КИК печени – ас- социаты сокультивированных аллогенных клеток печени крысы и мультипотентные мезенхималь- ные стромальные клетки мозга (ММСК КМ) крыс (рис. 4), для КИК поджелудочной железы – культур флотирующих островковых клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов (рис. 5). Функциональная активность КИК ХТч была исследована на модели адъювантного артрита с переходом в артроз (кролики породы Шиншилла).


Правый сустав служил отрицательным контролем, в левый вводили КИК ХТч. В контрольных суста- вах (отрицательный контроль) наблюдаются изъ- язвления и слущивания поверхностной пластины, обеднение глубоких слоев клетками, исчезновение колончатого строения, хаотичное расположение хрящевых клеток и очаговое разволокнение хряще- вого матрикса.После введения в поврежденный сустав КИК ХТч на 60-е сут имплантации в препаратах хряща обнаруживаются признаки частичного восстанов- ления структуры хряща, выражающиеся в форми- ровании хондроцитами колонок-столбиков в сред- нем слое, некотором оживлении поверхностного слоя (увеличение количества клеток), появлении изогенных групп хрящевых клеток в матриксе. По- лученный результат свидетельствует о наличии су- щественного регенеративного потенциала биомеди- цинского клеточного продукта КИК ХТч.


Для доказательства функциональной эффектив- ности КИК печени ее имплантировали в паренхиму печени крысы через 7 сут после завершения моде- лирования хронического токсического фиброзирующего повреждения печени (затравка крыс CCl4 в течение 42 сут). На 7-е сут после окончания затрав- ки наблюдали четко выраженные признаки фиброза (появление ложных долек печени). В контрольной группе крыс, которым вводили физиологический раствор, к 90-м сут после окончания затравки на- блюдали дальнейшее разрастание соединительной ткани и формирование внутридолькового фиброза с циррозом печени к 180-м сут. Напротив, в эк- спериментальной группе животных через 90 сут в клеточных структурах имплантированных клеточно-инженерных конструкций отмечался высокий уровень гликоген-аккумулирующей активности ге- патоцитов, а сами конструкции оказываются фун- кционирующими и полностью интегрированными печеночной тканью реципиента. Через 270 сут пос- ле имплантации клеточно-инженерные конструк- ции были полностью интегрированы печеночной тканью реципиента с образованием новых функ- ционирующих кровеносных сосудов и желчных протоков. Проведенные биохимические и гистоло- гические исследования показали, что имплантация предложенных клеточно-инженерных конструкций в паренхиму печени способствует дефиброзирова- нию ткани поврежденной печени и нормализации показателей функции печени по сравнению с кон- тролем.


Функциональная эффективность КИК поджелу- дочной железы в условиях in vivo была исследована путем ее внутрибрюшинного введения животным (крысы, Вистар) с экспериментальным сахарным диабетом 1-го типа (стрептозотоциновая модель). Определяли не только сахароснижающий эффект выполненной имплантации, но и ее влияние на ос- тровковый аппарат собственной поджелудочной железы крыс-реципиентов. Было отмечено сущест- венное снижение уровня гипергликемии, и к исходу 4–5-й нед. содержание глюкозы в крови не превы- шало 11 ммоль/л, субнормальный уровень которо- го сохраняется, по меньшей мере, на протяжении 8 нед. (заданный общепринятый срок наблюдения) после имплантации. По окончании эксперимента при гистологическом анализе поджелудочной же- лезы крыс-реципиентов с сахарным диабетом были выявлены признаки активной регенерации β-клеток в островке поджелудочной железы по сравнению с крысами из контрольной группы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты функци- ональной эффективности КИК хрящевой ткани и поджелудочной железы на экспериментальных мо- делях, ксеногенных относительно клеточной ком- поненты КИК, можно объяснить стимулирующим действием биомедицинских клеточных продуктов на процессы собственной регенерации поврежден- ного суставного хряща и поджелудочной железы. Учитывая низкую способность зрелых гепатоцитов к пролиферации, появление большого количества молодых гепатоцитов при имплантации КИК пече- ни на экспериментальной модели хронической пе- ченочной недостаточности в какой-то мере может быть также связано с ее способностью стимулиро- вать собственную регенерацию поврежденной пе- чени. Биостимулирующее действие разработанных КИК на регенерацию поврежденных структур, скорее всего, обусловлено интенсификацией процессов миграции стволовых клеток из окружающих тканей в зону поражения с последующей их дифференци- ровкой.

Исследование выполнено при финансовой под- держке РФФИ в рамках научных проектов 13-04- 12017 офи_м и в части разработки инъекционных форм клеточно-инженерных конструкций, при финансовой поддержке Минобрнауки в рамках Соглашения № 14.610.21.0001 в части разработ- ки экспериментальных моделей, при финансовой поддержке РНФ в рамках гранта № 14-25-00055 в части проведения гистоморфологического анализа.

Исследование частично профинансирова- но грантом Президента РФ по государствен- ной поддержке ведущих научных исследований НИ-6294.2014.7.

АО "БИОМИР сервис"
Б. Тишинский переулок,
д. 43/20 стр.2
+7 (499) 252-36-09